高考专题09 基因工程（选修三）
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基因工程的原理、操作、应用
1.什么是基因工程？基因工程导致的生物变异属于哪种变异类型？
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。基因工程导致的生物变异属于基因重组。2.与其它基因重组相比，基因工程的最大优点是什么？
能定向改造生物性状。
3.基因工程诞生的理论基础有哪些？
①美国科学家艾弗里等证明DNA是生物的遗传物质。②沃森和克里克提出DNA的双螺旋结构。③中心法则提出和遗传密码子的破译
4.基因操作的工具有哪些，分别在基因操作中起什么作用？
限制酶——切割载体和目的基因；DNA连接酶——连接DNA片段；载体——运载目的基因进入受体细胞。
5.限制酶一般来自什么生物，主要特点是什么，其作用的键是什么键，作用结果是什么？
来源：主要来自原核生物。
特点：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开，体现了酶的专一性。
作用键：磷酸二酯键
作用结果：DNA分子断裂形成黏性末端或平末端。
6.链状DNA和环状DNA上酶切位点种类和数量与酶切后DNA片段数之间有什么关系？
①单酶切
环状DNA分子：酶切片段数=限制酶识别序列数
线形DNA分子：酶切片段数=限制酶识别序列数+1
②双酶切
环状DNA分子：酶切片段数=两种限制酶识别序列数之和
线形DNA分子：酶切片段数=两种限制酶识别序列数之和+1
7.什么是目的基因？目的基因一般是什么类型的基因？
目的基因就是基因工程中被操作的外源基因。目的基因一般都是编码蛋白质的基因。
8.导入目的基因时为什么需要载体？
原因主要有三个：①目的基因在宿主细胞中往往不能稳定存在，独立复制和表达；②很难检测出独立的目的基因是否进入受体细胞；③目的基因独自进入真核细胞后很难整合的细胞染色体上，以致不能稳定遗传。
9.常用载体是什么，其化学本质是什么，来自什么生物？
常用载体是质粒，化学本质是小型双链环状DNA分子。主要来自原核生物。
10.作为基因的载体应该具备什么条件，为什么？
①能在受体细胞中复制并稳定保存；能使目的基因稳定遗传。
②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；
③具有标记基因（如抗性基因和颜色反应的基因），供重组DNA的检测和鉴定；
11.天然质粒能直接作基因载体吗，为什么？
天然质粒往往不能同时满足基因载体的全部条件，因此不能直接作载体。
12.除质粒外，基因工程中还可用什么载体？
还可以用噬菌体和动、植物病毒等作载体。
13.DNA连接酶与DNA聚合酶有什么异同？
相同点：DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化DNA中相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键。
不同点：DNA聚合酶的底物是双链DNA分子，不需要模板，作用结果是形成重组DNA；DNA 聚合酶的底物是脱氧核苷酸分子，需要DNA单链作模板，作用结果是合成新的DNA分子（DNA 复制）。
14.DNA中氢键的形成是否需要酶的催化，为什么？
不需要，因为氢键中的相互作用力非常弱，碱基互补配对时就能形成。
15.基因工程的基本步骤是什么？
①目的基因的获取；②重组DNA的构建（构建基因表达载体）；③将目的基因导入受体细胞；
④目的基因的检测与表达（目的基因的检测与鉴定）。
16.获取目的基因的途径有哪些？
从基因文库中直接获取；人工化学合成；利用PCR技术扩增。
17.什么叫基因组？什么叫基因组文库？
基因组是指细胞内决定人全部遗传性状的一组基因。如：人的基因组由1-22号常染色体上的DNA和X、Y染色体上的DNA共同构成，果蝇的基因组由2-4号常染色体和X、Y染色体上的DNA共同组成。
基因组文库指将含有某种生物全部基因的所有DNA片断，利用载体导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，全部受体菌群称为基因组文库。
18.部分基因文库和完全基因文库各是如何建立的？
部分基因文库是选取某种生物的部分基因构建的基因文库。完全基因文库是将某种生物的全部基因构建的基因文库，也就是基因组文库。
19.cDNA文库是如何建立的，它属于哪一类基因文库？
cDNA文库建立：以含目的基因的生物某个时期或某种细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的催化下反转录得到多种互补DNA（cDNA）片段，与载体相连后导入受体菌群中，这个受体菌群就是这种生物的cDNA文库。cDNA文库中因为只含有该生物的部分基因，因此属于部分基因文库。
20.构建基因文库需要哪些工具和技术？
构建基因组文库需要用到限制酶、载体、DNA连接酶，构建cDNA文库要用到限制酶、载体、DNA连接酶、逆转录酶。常用的技术包括凝胶电泳技术、PCR技术、转基因技术、分子探针技术等。
21.什么样的目的基因适宜从基因文库获取？
碱基对序列未知的基因。
22.什么类型的目的基因适宜人工化学合成，如何合成？
碱基对序列已知或基因所编码的蛋白质氨基酸序列已知，且碱基对数目相对较少的基因。前者利用DNA合成仪直接合成，后者先根据蛋白质的氨基酸序列推出可能的一种mRNA序列，再推出相应的DNA序列，然后利用DNA合成仪合成。
23.PCR技术的基本步骤是什么，需要用到哪些试剂？
PCR技术的基本步骤：一、变性：加热至90～95℃使DNA双链解链成单链；二、退火：冷却到55～60℃，与模板互补的特定引物结合到互补DNA链上；三、延伸：加热至70～75℃，TaqDNA聚合酶从引物起始催化互补链合成。
PCR需要用到的试剂：模板DNA分子（很少）、TaqDNA聚合酶、能与模板互补的特定引物对（大量）、四种游离脱氧核苷酸（大量）、缓冲液
24.PCR技术有哪些用途？核苷酸序列只有部分已知的基因能用PCR技术扩增吗？
凡是需要在体外大量扩增目的基因的内容都可用到PCR，如：基因工程、基因诊断、病毒分析等。核苷酸序列只有部分已知的基因，只要能根据这部分已知的序列合成出其特定引物对，就可用PCR技术扩增完整基因。
25.获取人胰岛素基因的最好方法是什么？如何获取？
获取人胰岛素基因的最好方法是人工化学合成法，即：根据胰岛素的氨基酸序列推测出其一种mRNA序列，再推测出其DNA序列，然后利用DNA合成仪人工化学合成。
26.人工化学合成的人胰岛素基因与从人类基因组文库中获取的人胰岛素基因核苷酸序列一定相
同吗，为什么？
基本上不可能相同。因为每一种氨基酸有一个或多个密码子，根据胰岛素氨基酸序列推导出的mRNA序列就会有很多种（假设每个氨基酸平均有3个密码子，胰岛素分子有51个氨基酸，根据密码子表推导出的mRNA序列就有351种之多。），相应的DNA序列也会一样多。而从人类基因组文库种获取的人胰岛素基因基本上是唯一确定的。
27.从人类基因组文库中获取的人胰岛素基因与从人类cDNA文库中获取的人胰岛素基因的碱基
对序列一样吗，为什么？
基本上相同。因为从cDNA文库种获取的基因是利用人胰岛素基因转录出的mRNA逆转录得到的，其序列与转录出mRNA的基因相同。
28.获取目的基因时可能用到哪些工具？
从基因组文库中获取目的基因需要用到：限制酶、载体、DNA连接酶；从cDNA文库中获取目的基因要用到：限制酶、载体、DNA连接酶、逆转录酶；利用PCR技术扩增目的基因需要用到：TaqDNA聚合酶；利用DNA合成仪合成目的基因需要用到：DNA聚合酶。
29.构建基因表达载体时要用到哪些工具？
载体、限制酶、DNA连接酶。
30.用来切割目的基因的限制酶和用来切割载体的限制酶有什么要求？
同种限制酶
31.实际操作中，常用两种限制酶切割质粒和目的基因，这样操作与只用一种限制酶切割比较，
有哪些优点？
一方面可以减少目的基因和载体自连，另一方面可以使目的基因与载体定向连接。
32.在构建基因表达载体（重组DNA）时，切割开的DNA片段一般有几种连接类型？
目的基因自连、载体自连、目的基因与载体重组
33.基因工程中常用的受体细胞有哪些？
动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等
34.基因工程中为什么常用原核生物作为受体细胞？
因为原核生物多为单细胞，操作简便；繁殖快、易培养；自身遗传物质少，基因表达产物种类少，易分离目的基因表达产物。
35.作为受体细胞的大肠杆菌与自然界的大肠杆菌有什么重要区别，为什么？
受体大肠杆菌没有抗性基因，这样便于筛选出导入重组DNA的转基因受体菌；另外，受体菌往往是营养缺陷性细菌，这样的细菌只能在人工培育下繁殖，可以避免已导入外源基因的细菌被带到自然环境时造成基因污染。
36.培育转基因植物时常用什么方法导入重组DNA，具体过程是怎样的？除此之外还可以用什么
方法？
培育转基因植物时常用“农杆菌转化法”，具体过程可表述为：目的基因插入Ti质粒的T-DNA 上→重组Ti质粒导入农杆菌→农杆菌将T-DNA导入植物细胞→T-DNA整合到受体细胞的染色体上→目的基因在受体细胞稳定表达。培育转基因植物还可用到“基因枪法”和“花粉管通道法”。
37.培育转基因植物时，还需要用到什么生物技术？
还需要到植物组织培养技术（将转基因细胞培育成转基因植株）。
38.培育“工程菌”时常用什么方法导入重组DNA，具体过程是怎样的？
“感受态细胞法”，具体过程是：Ca2+处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
39.将重组质粒导入细菌时用氯化钙处理的目的是什么？
增大细胞壁的通透性，使细菌处于感受态。
40.培育转基因动物时常用什么方法导入目的基因？
显微注射法
41.在培育转基因动物时，为什么常用受精卵作为受体细胞？
（1）受精卵体积较大，操作方便；（2）受精卵全能性最高，容易发育成完整个体。
42.培育转基因动物时需要用到哪些生物技术？
动物细胞培养、基因工程、体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植
43.如果是对人体进行基因治疗，常用的受体细胞是什么？
有基因缺陷的成体干细胞
44.为什么需要对目的基因进行检测和筛选？
（1）并不是所有细胞都接纳了重组DNA分子; （检测是否成功导入）
（2）目的基因导入受体细胞后，不一定能稳定维持和表达其遗传特性。（检测是否复制和表达）45.试举2-3例说明如何利用载体的标记基因对目的基因进行检测？
请同学们参阅相应试题：利用抗生素抗性基因检测——氨苄青霉素和四环素双抗性检测、利用颜色反应检测——蓝白筛选、绿色荧光蛋白检测
46.在分子水平上，如何进行检测？
（1）DNA分子杂交技术检测目的基因；（2）利用标记的目的基因作探针与mRNA杂交检测mRNA；（3）利用抗原－抗体杂交检测蛋白质
47.什么是分子探针？DNA分子杂交是原理是什么？
分子探针是指经过放射性同位素标记或荧光分子标记的一段目的基因片段。原理是碱基互补配对。
48.在细胞水平上，如何进行检测？
一般是检测细胞是否产生相应的基因表达产物——蛋白质。
49.在生物个体水平上，如何进行检测？
一般直接检测生物体的相应性状，如：把抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫是否中毒。
50.基因工程成功的标志是什么？
生物体高效表达相应的蛋白质并具备相应性状。
51.基因工程的操作中，哪些步骤发生了碱基互补配对？
获取目的基因时：把DNA片段与载体相连，重组DNA在大肠杆菌中复制、转录、翻译；逆转录得cDNA；利用PCR技术扩增DNA。
构建基因表达载体时粘性末端碱基互补配对。
目的基因检测和鉴定时：核酸分子杂交检测DNA和RNA，目的基因表达。
52.基因工程有哪些方面的应用？
（1）培育转基因植物：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
（2）培育转基因动物：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。
（3）基因诊断和治疗。（4）用于生态环境保护。
53.基因工程药品比直接从生物体的组织、细胞或血液中提取费用昂贵吗，为什么？
便宜。因为基因工程药品的生产常用微生物，便于工厂化生产，并且产量比从生物组织、细胞或血液中提取高得多。
54.什么是基因诊断，其基本原理是什么，需要用到哪些工具和技术？
基因诊断：根据需要检测的致病基因制备核酸探针，然后分离纯化待检测个体的DNA进行分子杂交。基本原理是碱基互补配对。一般需要用到的工具：DNA测序仪、超速离心机、PCR仪、电泳仪、荧光或紫外线检测仪等。技术包括DNA分离技术、测序技术、PCR、核酸杂交技术等。
55.什么是基因治疗，其基本原理是什么？
基因治疗:从病人体内获取有基因缺陷的相应细胞进行适当培养，利用基因工程技术把正常的外源基因导入缺陷细胞中，经过再次定培养后把成功导入正常基因的纠正细胞重新输入患者体内，使该基因表达产物发挥作用，达到治疗疾病的目的。也可以直接把携带正常基因的载体利用显微注射法注入病变组织细胞内达到治疗的目的。基因治疗可“一次性”解除病人的疾苦。其基本原理是基因重组。
56.什么是蛋白质工程，其基本步骤如何？
蛋白质工程：以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求。
基本步骤：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→推测对应的基因脱氧核苷酸序列→合成相应基因→利用基因工程将相应基因导入某种生物体内→转基因生物合成出预期的蛋白质。
57.蛋白质工程与基因工程有何联系和区别？
区别：基因工程是使基因实现了跨物种表达，原则上只能表达出自然界本来就存在的蛋白质。蛋白质工程是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计，最终生产处出自然界不存在的蛋白质。
联系：根据预期的蛋白质氨基酸序列合成出的新基因，必须利用基因工程的技术手段将其导入生物体内，才能使生物合成设计出的蛋白质。因此可以说蛋白质工程是基因工程的进一步发展，是第二代基因工程。
58.转基因技术的安全性问题包括哪些方面？
转基因技术的安全隐患只要有：食物安全、生物安全、环境安全。
59.转基因食品可能存在哪些安全隐患？如何克服这些隐患？
转基因食品的安全隐患:安全性检测问题、滞后效应、出现新的过敏原、营养成分的改变。克服隐患的措施：多环节、严谨的安全性评价,可以保证转基因食物的安全;科学家的负责态度可以防止新过敏原的产生;至今尚未发现食用转基因食品而影响人体健康的事例;没能足够的证据证明转
基因食物有问题。
60.转基因生物对生物和环境安全可能存在哪些隐患，如何克服这些隐患？
引起生物安全的理由：可能会扩散到种植区以外，成为野生种类；可能成为”入侵的外来物种”,威胁生态系统中其他生物的生存；可能重组出对人类或其他生物有害的细菌或病毒；可能使杂草成为除草剂除不掉的”超级杂草”。
不引起生物安全的理由:扩散到种植区以外会很快死亡，要表现出新性状,必须具有一定的水肥等条件,以及配套的种植技术；由于生殖隔离的存在,使他们很难与其他植物杂交,花粉传播的距离有限、存活时间有限。
引起环境安全的理由:打破自然物种的原有界限,改变了生态系统中能量流动和物质循环,重组微生物可能对人类的生活环境造成二次污染,重组DNA与微生物杂交,可能产生有害的病原微生物;转基因植物花粉中的有毒物质可通过蜜蜂进入蜜蜂,再经过食物链传递。
不引起环境安全的理由:转基因不会改变生物原有的分类地位,不会破坏生态系统的稳定性;转基因抗虫作物的种植,减少了农药的使用量;抗除草剂农作物的种植,减轻了农田管理的负担,保护了农田的土壤环境。
61.如何理性看待转基因技术？
科技的发展是人类社会发展的必然，人类应趋利避害，不应因噎废食。人类可以适当修改传统的法律和道德规范以适应科技的发展，但科技的发展必须以相应的法律和道德规范为准绳。
实验：DNA的粗提取与鉴定
1.该实验的基本原理是什么？
DNA在2mol/L的食盐溶液中溶解度很高，而蛋白质则被盐析，可以与DNA分离；DNA在0.14mol/L的食盐溶液中溶解度最低，可以析出；
蛋白酶能催化蛋白质水解，而对DNA不起作用，利用这一原理可以使DNA与蛋白质分离；
DNA不溶于95%的乙醇，而蛋白质等其他有机物可以溶解，可以利用95%的乙醇进一步纯化DNA分子。
DNA与二苯胺混合后，在沸水浴中反应一段时间呈现蓝色。
2.该实验所用的实验材料是什么？能用哺乳动物的新鲜血液作为该实验的实验材料吗，为什么？
原则上，凡是含DNA的生物材料都可以。但是实际往往选择DNA含量高，容易破裂的生物材料，如植物材料常用菜花，动物材料常用鸟类的血液、鱼白（鱼的精巢）。
不能用哺乳动物的新鲜血液做实验材料。因为哺乳动物血液中含量最多的细胞是成熟红细胞，而这些红细胞没有细胞核，自然也就提取不出DNA。虽然哺乳动物的血液中含有一些白细胞，白细胞中有细胞核，含有DNA，但必须用精密的方法和仪器才能提取出来，无法粗提取。鸟类的红细胞有细胞核，能够用来提取DNA。
3.实验中有几次加清水的过程，每次加清水的目的是什么？
至少有两次加清水的过程。第一次向鸡血中加清水，目的是使鸡血中的红细胞吸水破裂，释放出内含物；第二次是向溶有DNA的2mol/L的食盐溶液中加清水，目的是使食盐溶液浓度下降到0.14mol/L，让其中的DNA析出。
4.实验中有几次过滤，每次过滤的目的是什么，保留的成分是什么，为什么？
至少有两次过滤。第一次是过滤破裂的红细胞溶液，保留滤液，因为含DNA的物质在滤液中；第二次是过滤溶有第一次粗提取出的DNA的2mol/L的食盐溶液，保留滤液，因为DNA溶解在其中。
5.实验中加嫩肉粉的目的是什么，为什么？
嫩肉粉中含有木瓜蛋白酶，能水解蛋白质，对DNA不起作用，可以使蛋白质与DNA分离，到达纯化DNA的目的。
6.实验中加入冷却酒精的目的是什么？
DNA分子不溶于酒精，而蛋白质溶于酒精，加入酒精可以溶解蛋白质，沉淀出粗提取的DNA。
7.实验中鉴定DNA的试剂是什么，如何鉴定，最终显什么颜色？
鉴定DNA的试剂是二苯胺。将二苯胺与DNA混合后沸水浴加热，最终呈蓝色。
8.如果DNA在细胞中没有提取出来，如何鉴定其分布？
细胞中的DNA用甲基绿染色，把染色的材料制成临时装片，用显微镜观察显蓝绿色。
第二章习题 一、单选题 1.在基因操作中所用的限制性核酸内切酶是指（ B ） A．I类限制酶 B. II类限制酶 C. III类限制酶 D.核酸内切酶 E. RNAase 2.下列关于同裂酶的叙述错误的是( B ) A. 是从不同菌种分离到的不同的酶,也称异源同工酶。 B. 它们的识别序列完全相同。 C. 它们的切割方式可以相同，也可以不同。 D. 有些同裂酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。 E. 两种同裂酶的切割产物连接后，可能会丢失这两个同裂酶的识别位点。 3. 多数限制酶消化DNA的最佳温度是（ A ） A. 37℃ B.30℃ C.25℃ D.16℃ E.33℃ 4. 下列关于限制酶的叙述错误的是( B ) A. I类限制酶反应需要 Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸。 B. II类限制酶反应需要Mg2+、ATP。 C. III类限制酶反应需要Mg2+、ATP，S-腺苷蛋氨酸能促进反应，但不是绝对需要。 D. I、III类限制酶对DNA有切割和甲基化活性，II类限制酶对DNA只有切割活性而无甲基化活性。 E. II类限制酶要求严格的识别序列和切割点，具有高度精确性。 5. 如果一个限制酶识别长度为6bp ,则其在DNA上识别6bp的切割概率为( D ) A. 1/44 B. 1/66 C. 1/64 D.1/46 E. 1/106 6. 多数II类限制酶反应最适PH是 ( C ) A. PH:2-4 B. PH:4-6 C. PH:6-8 D. PH:8-10 E. PH:4-10 7. 下列关于限制酶反应的说法错误的是 ( D ) A. 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，可能会阻碍限制酶的酶解活性。 B. 许多限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的切割活性是有明显差异的。 C. 有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。 D. 限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。 E. BSA对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的BSA。 8. II类限制酶反应中必须的阳离子是（ C ）
基因工程实验 教学方案 湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室 指导教师：吴娟
实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株 Ⅰ质粒DNA的提取 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。 实验原理 1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。 2．设计构建体外重组DNA分子 构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。 附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图：
仪器材料与试剂 （一）仪器 1．恒温摇床 2．台式离心机 3．漩涡混合仪 （二）材料与试剂 1．含pGEX-mreB质粒的大肠杆菌DH5α 2．含pGEX质粒的大肠杆菌DH5α 3．液体LB培养基 4．100mg/mL氨苄青霉素Amp 5．新捷质粒提取试剂盒 实验步骤 分为两组：一组提取质粒pGEX-mreB，另一组提取质粒pGEX。 1）12000rmp 离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul 已加入Rnase A的Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。 2）加入250ul Buffer Ⅱ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。 3）加入350ul Buffer Ⅲ,温和并充分地翻转离心管4-6次。 4）13000 rmp 离心10分钟。 5）将核酸纯化柱置于2ml 离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。 6）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。 7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000 rmp离心1分钟。 8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。 9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。 实验结果 实验安排 3个小时
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
基因工程练习题 1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是( ) A、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的DNA核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞 2、基因工程中常用细菌等原核生物作受体细胞的原因不包括( ) A、繁殖速度快 B、遗传物质相对较少 C、多为单细胞，操作简便 D、DNA为单链，变异少 3、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因可以用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测 4、运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有( ) A、抗虫基因 B、抗虫基因产物 C、新的细胞核 D、相应性状 5、转基因动物转基因时的受体细胞是( ) A、受精卵 B、精细胞 C、卵细胞 D、体细胞 6、基因工程中常见的载体是( ) A、质体 B、染色体 C、质粒 D、线粒体 7、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是( ) A、促使目的基因导入宿主细胞中B、促使目的基因在宿主细胞中复制 C、使目的基因容易被检测出来 D、使目的基因容易成功表达 8、运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白质，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，据以上信息，下列叙述正确的是( ) A、Bt基因的化学成分是蛋白质 B、Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C、转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因 D、转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物 9、人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成，通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A、大肠杆菌 B、酵母菌 C、T 噬菌体 D、质粒DNA 4 10、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（） A．能复制 B.有多个限制酶切点C．具有标记基因D．它是环状DNA
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
基因工程原理习题集参考答案 一、名词解释 1、DNA分子克隆技术：克隆，指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程。DNA分子克隆技术也称基因克隆技术，是在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库，另一种是cDNA库。 2、分子杂交：两条不同来源的DNA（或RNA）链或DNA与RNA之间存在互补顺序时，在一定条件下可以发生互补配对形成双螺旋分子，这种分子称为杂交分子。形成杂交分子的过程称为分子杂交。 3、限制性片段长度多态性：从不同个体制备的DNA，使用同一种限制性内切酶酶切，切得的片段长度各不相同。酶切片段的长度可以作为物理图谱或者连接图谱中的标记子。通常是在酶切位点处发生突变而引发的。 4、报告基因：一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个表达产物非常容易被鉴定的基因、 5、多聚酶链式反应（PCR）：一种体外扩增DNA的方法。PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两个单链引物。以过高温变性将模板DNA分离成两条链。低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的游离核苷酸紧接着引物从5/端到3/端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数目不断倍增。 6、核酸的凝胶电泳：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的摩擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极向正极移动。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭进行染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。 7、细菌转化：所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致遗传特性发生改变的过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的菌株则叫做受体菌株。大肠杆菌是使用最广泛的实验菌株。 8、反义核酸：指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之结合的一段DNA或RNA。 9、RNA interference：是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制范畴。 10、Spi：λ噬菌体体重组克隆的一种筛选方法，其筛选方法是Spi+：λ不能感染E.coli(p2)；Spi-：λ(red- gam-)能感染E.coli(p2),形成小噬斑/host recA+/chi。λ包装时若gam- ,需recA
基因工程实验指导书
缩略词表
实验一植物总DNA 的抽提及电泳检测 一【实验目的】 1、了解植物DNA抽提的主要方法； 2、掌握快速抽提DNA的方法。 3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法； 4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素； 5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。 二【实验原理】 该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。CTAB能溶解于乙醇。 改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来 B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的 4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养
基上生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶 的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有 D.转基因牛的肌肉细胞中也有人白蛋白基因，但不发生转录、翻译，不能合成人白蛋白 6.下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是( )
名词解释 基因工程：用人工方法, 在体外对DNA分子进行切割、连接，组成重组DNA分子，再导入生物体内,并使其在异种生物内复制、表达,从而使受体生物获得新的遗传性状,这一全过程称为基因工程。（PPT） 限制酶：限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。（P 21页） DNA连接酶：DNA连接酶是一种能够将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。 （或DNA连接酶是一种能够催化双链DNA片段紧靠在一起的3`羟基末端与5`磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶）（P 27页） DNA聚合酶：DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶。（P 30页）DNA修饰酶：DNA修饰酶是一类通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，主要有末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）、碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶等。（P 22页与网上整理结合） 质粒：质粒是一些存在于微生物细胞染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。（P 42页） 穿梭质粒：穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制，并可以携带着外源DNA在不同物种的细胞之间往返穿梭的质粒载体。（P 56页）： 噬菌粒：噬菌粒是一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列。（P 77页）粘粒载体：粘粒又称柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λDNA粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。（P 70页） M13噬菌体载体： M13噬菌体是一种含有6.4kb环状单链DNA分子的大肠杆菌丝状噬菌体。（73页及PPT） 克隆载体：克隆载体是指具有在细胞内进行自我复制能力的DNA分子，是外源基因的运载体，
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
第二章 1. 名词解释：核酸内切酶、核酸内切限制酶、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、末端脱氧核苷酸转移酶 答： 核酸内切酶：是一类从多核苷酸链的内部催化磷酸二酯键断裂的酶。 核酸内切限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。 核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。 末端脱氧核苷酸转移酶：可以不需要模板，在单链DNA或突出的双链DNA 3’-OH端随机 添加dNTPs的酶 2. 限制性内切核酸酶的命名原则是什么？ 答：限制性内切核酸酶按属名和种名相结合的原则命名的，即：属名+种名+株名+序号； 首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写； 第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写； (2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。 第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。 顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。 3．部分酶切可采取的措施有哪些？ 答：1）缩短保温时间 2）降低反应温度 3）减少酶的用量 4. 在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 答：回文序列是：5'-CATA TG-3， 5．什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响? 答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松 动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星 活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性 内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。 第三章 1．如何将野生型的λ噬菌体改造成为一个理想的载体? 答：①删除λ噬菌体的非必需区，留出插入空间；并在余下的非必须区内制造限制酶切点 ②引进某些突变表型，作为选择标记 ③突变某些基因，使它成为安全载体 ④删除λDNA必须区段上常用的限制酶切点
《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料
限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内
xxxXXXXX 学校XXXX 年学年度第二学期第二次月考 XXX 年级xx 班级 姓名：_______________班级：_______________考号：_______________ 一、选择题 （每空？ 分，共？ 分） 1、下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是 A ．蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的 B ．基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以不是天然存在的蛋白质 C ．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平（或性状水平）操作 D ．基因工程完全不同于蛋白质工程 2、PCR 是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术，下列有关PCR 过程的叙述，不正确的是 A ．变性过程中破坏的是DNA 分子内碱基对之间的氢键 B ．复性过程中引物与DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C ．延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 、四种核糖核苷酸 D ．PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需要酶的最适温度较高 3、35．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。下列有关叙述，正确的是（ ） A ．人体细胞中凝血因子基因的碱基对数目，小于凝血因子氨基酸数目的3倍 B ．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA 分子导入羊的受精卵 C ．在该转基因羊中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中 D ．人凝血因子基因开始转录后，DNA 连接酶以DNA 分子的一条链为模板合成mRNA
4、ch1L基因是蓝细菌拟核DNA上控制叶绿素合成的基因．为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞．技术路线如图所示，对此描述错误的是（） 5、下图表示基因工程中目的基因的获取示意图，不正确的是： A、同种生物的基因组文库大于cDNA文库 B、③表示PCR技术，用来扩增目的基因 C、从基因文库中要得到所需目的基因，可根据目的基因的有关信息来获取 D、只要基因的核苷酸序列已知，就只能通过人工合成的方法获取 6、图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序 列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为：C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。下列分析中正确的是：
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第一章绪论 一、填空题 1．基因工程是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞生，使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代，走向按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种的时代。 2．随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过细菌发酵、真核细胞培养和乳腺生物反应器等三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治病。 3．Cohen 等在1973年构建了第一个有功能的重组DNA分子。 4．基因工程的两个基本特点是：(1) 分子水平上的操作，(2) 细胞水平上的表达。 5．基因克隆中三个基本要点是：克隆基因的类 型；受体的选择和载体的选 择。 6．1972年，美国斯坦福大学P．Berg 等在Proc．Natl．Acad．Sci．USA上发表了题为：“将新的遗传信息插入SV40 病毒DNA 的生物化学方法：含有λ噬菌体基因和E．coli 半乳糖操纵子的环状SV40 DNA”的论文，标志着基因工程技术的诞生。这一工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重
组的DNA 分子具有生物学功能。7．克隆基因的主要目的有四个：(1) 扩增 DNA；(2) 获得基因产物；(3) 研究基因表达调控；(4) 改良生物的遗传性。 二、选择题(单选或多选) 1．因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是( C) (a)A．Komberg (b)W．Gilbert (c)P．Berg (d)B．McClintock 2．第一个作为重组DNA 载体的质粒是( C) (a) pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 3．第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是( A) (a)EcoRI (b)EcoB (c)EcoC (d)EcoRⅡ 4．P Berg 构建SV40 二聚体时用了几种不同的酶，其中( B)的作用是制造隐蔽的5’端。 (a)末端转移酶(b)λ外切核酸酶(c)外切酶Ⅲ (d)DNA连接酶 三、简答题 1．为什么说基因工程技术是60 年代末70 年代初发展起来的? 答：这是因为：(1)1967 年发现了连接酶；(2)大肠杆菌的转化技术是1970年获得突破；(3)限制性内切核酸酶的分离始