作业一：
一、名词解释：
1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有
遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。
2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部
DNA分子
3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转
录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。
4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至
少一个转录起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。
5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV4
0病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。
增强子通常占100～200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。
6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信
息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
二、简答题
1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.
2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？
答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：
(1)高甘油含量(>5％, v／v)；
(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；
(3)低离子强度(<25 mmol／L)；
(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；
(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3、影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？
答：（1）DNA的纯度（2）DNA甲基化的程度（3）酶切消化反应的温度（4）DNA的分子结构（5）核酸内切限制酶的缓冲液
4、什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。
Klenow酶主要有下列用途：
(1)修复反应，制备平末端
可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。
用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。
(2) 标记DNA3'突出末端(protruding end)
该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫
交换或取代反应(exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。
(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链DNA探针等。
5、细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途？
答：主要差别是：CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。应用：
(1)dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，再进行连接反应。
(2)DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。
三、论述题
1、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?
答：可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。
作业二：
一、名词解释：
1、基因工程：在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接，构成重组DNA分子并导入相应受体细胞，使外源基因在受体细胞中进行复制、表达，使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或进行定向改造生物性状。简单概括，就是将外源目的基因与载体重组后再进入宿主细胞的过程。
2、载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
3、转化：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。
4、感染：利用噬菌体将外源DNA导入宿主细胞的方法。
5、转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是
细菌之间传
递遗传物质的方式之一。其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的
感染转移到另一个细胞中。
6、转染：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。常用的方法有电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体融合法等。
二、简答题
1、YAC载体具有什么样的功能性DNA序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？
答：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA 复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这
是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
2、列举质粒载体必须具备的4个基本特性。
答： (1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点；
(4)能转化但不扩散。
3、PCR的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？
答：)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
4、cDNA克隆与基因组克隆有何不同？
答：基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。
5、怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去？
答：化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。
三、论述题
什么是Western印迹？它与Southern印迹有什么不同
答： Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。
作业三：
一、名词解释
1、DNA变性：DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。
2、DNA复性：变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。
3、退火：指模板双链DNA经热变性，螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到55℃左右，使引物(即具有互补碱基的RNA片段)与该模板DNA 单链重新配对，形成新的双链分子的过程。
4、DNA芯片：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。
5、错义突变：碱基替换的结果引起氨基酸顺序的变化。
6、基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。
二、简答题
1、什么是蓝白斑筛选法？
答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。
外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚— —D—半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。
2、什么是基因文库？
用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。
3、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。
答：黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；
(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。
4、什么是同聚物加尾连接法？用何种方法加尾？具有哪些优缺点？答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH 端逐个添加单个核苷酸。
同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：．(1)首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。
5、何谓接头连接法？
答：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列)，加到载体或外源DNA的分子上，这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子，这种方法称为接头连接法。
三、论述题
1、什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?
答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA 导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。
作业四：
一、名词解释
1、DNA重组：是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。
2、克隆：科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
3、DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质——同源或异源、原核或真核、天然或人工的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。
4、目的基因：把需要研究的基因称为目的基因。（一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。）
5、基因载体：基因载体是把基因导入细胞的工具，他的作用是①运载目的基因进入宿主细胞，②使之能得到复制和进行表达。
6、质粒：质粒（plasmid）是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质，为双股闭合环形的DNA,存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
二、简答题 1、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？
答：限制性内切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA连接酶,碱性磷酸酶,末端脱氧核苷酸转移酶. 限制性内切核酸酶, 能够识别特异的DNA碱基序列， DNA碱基序列往往呈回文对称结构； DNA 聚合酶 a 位于细胞核内，也许是复合物，有催化细胞增生的作用； Klenow 大片段它也可以通过基因工程得到，分子量为 76kDa 。 DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。碱性磷酸酯酶的作用是从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基。末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到DNA分子的3`-OH末端。
2、重组DNA技术常包括哪些基本步骤？
答：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；
③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。在具体工作中选择哪条技术路线；⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。
3、常用的目的基因的获取方法有哪些？
答：直接获取从基因文库中提取目的基因，使用PCR扩增技术获得目的基因; 人工合成.
4、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些？
答：外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，
主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用．一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：（1）实验步骤要尽可能地简单易行；（2）连接形成的"接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；（3）对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。
5、解释质粒，为什么质粒可作为基因载体。
答：质粒是细菌拟核裸露DNA外的遗传物质。质粒：（1）具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
三、论述题 1、何谓限制性核酸内切酶？写出大多数限制性核酸内切酶识 DNA 序列的结构特点。
答：限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA双链结构的水解酶. 是在DNA分子内部切割，水解磷酸二酯键的核酸内切酶。能够识别特异的DNA碱基序列， DNA 碱基序列往往呈回文对称结构；并具有特异切割位点。
作业五：
一、名词解释
1、限制性核酸内切酶：是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。
2、基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。
3、cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA文库。
4、RFLP：RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
5、核酸探针：是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。
6、转录：转录是遗传信息由DNA转换到RNA的过程。作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA以及非编码RNA（tRNA、rRNA等）的合成步骤。
二、简答题： 1、试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？答：外因：是可以预见的，如反应条件（缓冲液、反应温度、反应时间、终止酶切的方法）、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污
染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积等等;内因：星星活性、末端长度、位点偏爱、甲基化底物、底物的构象。
2、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？
答：将外源DNA或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体载体具备的特点：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制③有一定的选择标记，用于筛选④最好具有较高的拷贝数，便于制备。
3、什么叫基因工程（Gene Engineering），试从理论和技术两个方面谈谈 Gene Engineering 诞生的基础？
答：基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原来没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。理论基础：近几十年来，由于受到分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学的研究取得了前所未有的进步。而这些学科的综合成就，又为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础：①在40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题；②在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题；③在50年代末期和60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。技术基础：①60年代-70年代，限制性核酸内切酶和DNA连接酶解决了对DNA分子进行体外的切
割和连接；②基因克隆载体的出现③大肠杆菌转化体系的建立④60年代发展的琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交技术对DNA片段的分离和检测十分有用。
4、抗性基因是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？
答：氨苄青霉素抗性基因ampr 、四环素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr 、卡那霉素和新霉素抗性基因kanr ①氨苄青霉素抗性基因ampr: 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应. 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化b-内酰胺环水解（水解青霉素），从而解除了氨苄青霉素的毒性。②四环素抗性基因tetr：四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
5、YAC 载体具有什么样的功能性元件？为什么它在克隆大片段时具有很大的优越性？
答：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括自主复制序列ARS，一个着丝粒，两个端粒，选择标记，筛选模型。优越性：YAC能够容纳长达几百Kb的外源DNA，这是质粒和粘粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。YAC有灵活性，可作为质粒在E.coil中增殖；与大片段连接时，可导入酵母，作为
真正染色体在酵母复制中有丝分裂。
三、论述题 1、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？
答：同：①原理相同。琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质，可降低对流运动，故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。②凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小；浓度越高，空隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。异：琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为02.Kb-50Kb之间；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范围为1-1000bp，分离小片段效果最好，分辨率极高，相差1bp的DNA也可分开。
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来 B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变 C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的 4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养
基上生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶 的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有 D.转基因牛的肌肉细胞中也有人白蛋白基因，但不发生转录、翻译，不能合成人白蛋白 6.下列关于蛋白质工程和基因工程的比较，不合理的是( )
基因工程及其应用文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
第2节基因工程及其应用（第1课时）知识链接及考试地位 本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA 重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。 知识回顾 1、DNA分子的结构特点是什么？ 2、什么是基因重组？ 学习目标 1、简述基因工程的诞生。 2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。 重难点 1．教学重点 基因工程的基本原理。 2．教学难点 基因工程的基本原理 新知探究
传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。 一、基因工程的原理 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的 水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是 指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。 基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。 二、基因工程的原理、操作对象各是什么？ 三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？ 四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？ 五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？ 六、基因工程的优点是什么？ 七、基因重组与基因工程比较
基因工程各章知识点 第一章绪论 1．基因工程的首例操作实验 三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定 三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用 基因工程的诞生： 72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子 73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性 S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌 2．基因工程的基本概念 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。 供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。 3．基因工程的基本操作过程 a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。 b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。 c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。 d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。 e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 第二章载体 1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定 PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。 如果在pBR322质粒的Tet r基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tet r基因编码序列的连续性，使tet r 失去活性，产生出Amp r Tet s表型的重组pBR322质粒，转化入Amp s Tet s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp r菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Amp r基因内位点插入外源DNA片断，则反之。 PUC18作载体的克隆外源基因的原理：
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单
5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 （时间：90分钟分数：100分） 一．选择题（本大题包括25题，每题2分，共50分。每题只有一个选项符合题意。） 1．以下说法正确的是（） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不．相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3．有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4．能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是（） A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养人的B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6．PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7．以下对DNA的描述，错误的是（） A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（） A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9．细胞工程的发展所依赖的理论基础是（） A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10．下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是：（） A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11．在以下4种细胞工程技术中，培育出的新个体中，体内遗传物质均来自一个亲本的是（） A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12．动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是（） A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13．下列哪一项属于克隆（） A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C．将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
1．3 基因工程的应用 1．举例说出基因工程的应用及取得的丰硕成果。(重点) 2.了解基因工程的进展。3．了解基因工程在农业和医疗等方面的应用。(难点)
一、植物基因工程的成果(阅读教材P17～P20) 植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。 1.抗虫和抗病转基因植物 2. (1)抗逆基因：调节细胞渗透压的基因使作物抗盐碱、抗干旱；鱼的抗冻蛋白基因使作物耐寒；抗除草剂基因使作物抗除草剂。 (2)成果：烟草、大豆、番茄、玉米等。 3．利用转基因改良植物的品质
植物基因工程成果表现 “三抗一优良”，三抗是指“抗虫”“抗病”和“抗逆”，一优良是指转入的优良基因表达的性状表现优良。 二、动物基因工程的前景(阅读教材P20～P21)
三、基因工程药物(阅读教材P21～P23) 1.药物来源：转基因的“工程菌”。 2.成果：重组人胰岛素、细胞因子、抗体、疫苗、激素等。 四、基因治疗(阅读教材P23～P24) 1.概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。 2．成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。 3．方法 (1)体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，如T淋巴细胞，进行培养。然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。 (2)体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。 连一连 判一判
(1)转基因抗虫棉的Bt毒蛋白基因能抗病毒、细菌、真菌。(×) (2)“转基因植物”是指植物体细胞中出现了新基因的植物。(×) 分析：转基因植物是指细胞中被转入了外源基因的植物，并非出现新基因。 (3)(2018·宿迁高二检测)基因工程中，要培育转基因植物和动物，选用的受体细胞都是受精卵。(×) (4)利用工程菌可生产人的胰岛素等某些激素。(√) (5)(2018·绵阳高二期末)直接在患者组织细胞中，进行改造致病基因的方法为体内基因治疗。(×) (6)基因治疗又叫基因诊断。(×) 三种转基因生物的生产过程
基因工程核心知识点 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形 成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 *比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。 （4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA 连接酶的异同点。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。 2.获得目的基因的方法
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作程 序四个步骤；基因工程在农业和医疗等方面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基因； 利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个方面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀” （1）限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二
酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。 注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA 聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。 ②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性内切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分内容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习内容，不能仅仅着眼于记住这几 个条件，而应该深入思考每一个条件的内涵， 通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些 条件才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链
知识点一基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA 重组技术。 注意：对本概念应从以下几个方面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀” (1)限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 (2)限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。 (3)限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA 切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA 连接酶——“分子缝合针” (1)来源：大肠杆菌、T4噬菌体 (2)DNA 连接酶的种类：E.coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶。 (3)作用及作用部位：E.coliDNA 连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA 连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。 注意：比较有关的DNA 酶 (1)DNA 水解酶：能够将DNA 水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基 (2)DNA 解旋酶：能够将DNA 或DNA 的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA 解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温(如94℃)、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。(3)DNA 聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA 长链。 (4)DNA 连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA 的缺口。注意比较DNA 聚合酶和DNA 连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
-高考生物基因工程专项知识点 基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力 的手段，下文是为考生准备的生物基因工程专项知识点的内容。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键断开，因此具有专一性。 (3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是??质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 (1)原理：DNA双链复制 (2)过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链;第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链;第三步：加热至70～
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和 ，赋予生物以新的，创造出更符合人们需要的新的和 。基因工程是在上进行设计和施工的，又叫做。 基因工程育种的原理：；优点：、 （一）基因工程的基本工具（工具酶：、） 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种的核苷酸序列，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：末端和末端。（4）限制酶自身DNA，原因是原核生物中或识别序列已经被。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于，只能将双链DNA片段互补的之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合，但连接平末端的之间的效率较。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端， 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②。 ③。 （2）最常用的载体是 ,它是一种裸露的、结构简单的、独立于之外，并具有的 DNA分子。 （3）其它载体：、 . (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：。
2.获取目的基因的方法有、 和。 3.基因文库是指：将含有某种生物的许多DNA片段，导入 中储存，各个受体菌分别含有这种生物的，称为基因文库。包含了一种生物所有的基因，这种基因文库称为；包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库称为，如。 获取目的基因的依据有哪些？如、、 、、。 4.PCR技术扩增目的基因 （1）原理： （2）特点： （3）条件：（）、、（）、（）。 （4）仪器：。 5.人工合成目的基因的方法有：、。第二步： ----也是基因工程的 1.目的：。 2.组成：＋＋＋ （1）启动子含义及作用： 。 （2）终止子含义及作用：。 注意与终止密码子的区别 （3）标记基因的作用：。 常用的标记基因是、。 第三步： 1.转化的概念：是进入受体细胞内，并且在受体细胞内的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有和 等。其中单子叶常有的方法是。
xxxXXXXX 学校XXXX 年学年度第二学期第二次月考 XXX 年级xx 班级 姓名：_______________班级：_______________考号：_______________ 一、选择题 （每空？ 分，共？ 分） 1、下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是 A ．蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的 B ．基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以不是天然存在的蛋白质 C ．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平（或性状水平）操作 D ．基因工程完全不同于蛋白质工程 2、PCR 是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术，下列有关PCR 过程的叙述，不正确的是 A ．变性过程中破坏的是DNA 分子内碱基对之间的氢键 B ．复性过程中引物与DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C ．延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 、四种核糖核苷酸 D ．PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需要酶的最适温度较高 3、35．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。下列有关叙述，正确的是（ ） A ．人体细胞中凝血因子基因的碱基对数目，小于凝血因子氨基酸数目的3倍 B ．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA 分子导入羊的受精卵 C ．在该转基因羊中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中 D ．人凝血因子基因开始转录后，DNA 连接酶以DNA 分子的一条链为模板合成mRNA
4、ch1L基因是蓝细菌拟核DNA上控制叶绿素合成的基因．为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞．技术路线如图所示，对此描述错误的是（） 5、下图表示基因工程中目的基因的获取示意图，不正确的是： A、同种生物的基因组文库大于cDNA文库 B、③表示PCR技术，用来扩增目的基因 C、从基因文库中要得到所需目的基因，可根据目的基因的有关信息来获取 D、只要基因的核苷酸序列已知，就只能通过人工合成的方法获取 6、图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序 列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为：C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。下列分析中正确的是：
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
基因工程测练题 1、将人的抗病毒干扰基因“嫁接”到烟草的DNA分子中，可使烟草获得抗病毒的能力，形成转基 因产品。试分析回答： (1) 人的基因工程之所以能接到植物体中去，原因是：。(4)不同生物间基因移植成功，说明生物共有一套，从进化的角度看，这些生物具 有。 (3) 烟草具有抗病毒能力，说明烟草体内产生：。 (4) 烟草DNA分子被“嫁接”上或“切割”掉某个基因，实际并不影响遗传信息的表达功能。这说 明。 (5) 有人认为，转基因新产品也是一把双刃剑，有如船能载舟也能覆舟，甚至可能带来灾难性的 后果，你是否支持这一观点？如果支持，请你举出一个可能出现的灾难性后果的实例： 。 2、1990年对一位缺乏腺苷脱氨酶基因，而患先天性体液兔疫缺陷病的美国女孩进行基因治疗， 其方法是首先将患者的白细胞取出作体外培养，然后用逆转录病毒将正常腺苷脱氨酶基因转入人工培养的白细胞中，再将这些转基因白细胞回输到患者的体内，经过多次治疗，患者的免疫功能趋于正常。 （1）在基因治疗过程中，逆转录病毒的作用相当于基因工程中基因操作工具中的，此基因工程中的目的基因是，目的基因的受体细胞是。 （2）将转基因白细胞多次回输到患者体内后，兔疫能力趋于正常是由于产生了，产生这种物质的两个基本步骤是、。 3、在植物基因工程中，用土壤农杆菌中的Ti质粒作为运载体，把目的基因重组入Ti质粒上的 T-DNA片段中，再将重组的T-DNA插入植物细胞的染色体DNA中。 （1）科学家在进行上述基因操作时，要用同一种分别切割质粒和目的基因，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过而黏合。 （2）将携带抗除草剂基因的重组Ti质粒导入二倍体油菜细胞，经培养、筛选获得一株有抗除草剂特性的转基因植株。经分析，该植株含有一个携带目的基因的T-DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，在该转基因植株自交F1代中，仍具有抗除草剂特性的植株占总数的，原因。（3）种植上述转基因油菜，它所携带的目的基因可以通过花粉传递给近缘物种，造成“基因污染”。如果把目的基因导入叶绿体DNA中，就可以避免“基因污染”，原因是: 。