原核蛋白表达常见问题解析1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1m

原核表达及纯化总结

pET载体诱导表达 载体诱导表达——经典的表达系统 载体诱导表达 经典的表达系统表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？ 表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决

蛋白体外表达与纯化随着后基因组时代的到来，蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者，其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统，真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。一：原核表达系统原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表，大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系，这也是外

tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21T7启动子需要能够提供T7 RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌抗性细胞不能与载体带有相同的抗性： pET-28a +

大规模可溶性蛋白纯化实验操作Hao Lab in SII1. 取20 µL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 µg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 µg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。2. 取

原核表达及纯化总结His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µL DH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入300µL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/mi

•1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。•2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核

三、凝胶滞留试验（EMSA）凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针

记录测定结果。 用灭菌水清洗侦测台5-6次，退出系统，关闭计算机。 在进行SDS-PAGE分析时，若表达的蛋白与实际大小不相符，原因可能是： • 由于静电荷的原因相差10kDa左

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纯化方法的组合需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适 用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序。 例如：His蛋白纯化时，要小心Buffer中螯合剂（EDTA）

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11作者简介:吴　爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化吴　爽1,2,耿建国2(1广东药学院基础学院组织胚胎

原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。37℃，过夜摇菌。2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：

三、凝胶滞留试验（EMSA）凝胶迁移滞留试验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针

原核蛋白表达纯化条件优化方案1，收菌每10ml一EP管，弃上清后-40度冻存。（一）缓冲液PH的确定：2，处理镍柱：（流速控制在30d/min, 5ml注射器）1）用3-5ml去离子水洗柱；2）1ml硫酸镍挂柱；3）3-5ml去离子水洗去余镍；3，取出菌体20管，每4管（40ml）为一组，分为5组。菌体沉淀置于冰浴中解冻，分别用1ml PH6.0,6.5,7

N端融合：易于构建。终止密码子来自载体/基因 表达量高 提前终止会干扰纯化 二级翻译起始不影响纯化C端融合：构建时注意避免移码 基因不能自带终止密码子 提前终止不影响纯化 二级翻译

全式金蛋白表达与纯化的实验常用表达条件的优化• 培养基组分 • 温度 • IPTG浓度 • OD值 • 培养体积与溶氧量全式金蛋白表达与纯化的实验原核表达策略选择 ➢根据实验目的选

实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。三．实验用品１.材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL

蛋白表达、纯化服务技术服务手册（2014版）活性蛋白整体方案目录重组蛋白表达服务 (1)原核蛋白表达服务 (1)可溶保证型原核蛋白表达服务（不成功，零收费，基因免费） (1)原核上清保证型服务 (2)重组蛋白表达鉴定服务 (3)蛋白复性服务 (3)高密度发酵服务 (4)哺乳动物蛋白定制服务 (5)瞬时转染蛋白表达服务 (5)稳定转染蛋白表达服务 (6)重组抗