原核表达及纯化总结

原核蛋白的表达、分离和纯化实验原理：携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。

蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤：一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。

3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM2-ME，pH8.0。

4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。

6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

模块二原核表达和纯化一、实验目的1、获得最佳的表达条件和纯化方法。

2、学习和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白技术。

二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂过硫酸胺，TEMED作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。

聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成的网状结构。

具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果更好。

外源基因通过表达载体进入宿主细胞后，会利用宿主的蛋白表达体系表达外源蛋白。

理论上看，只要载体具有良好的表达调控元件，就能成功地表达。

但实际情况不是这么简单。

(1)每次转化获得的菌落，其表达外源蛋白的潜力可能是不一样的。

我们一般认为，同样的质粒和感受态细胞，虽然长出来了不同菌落，但显然它们的遗传物质是一模一样的，所以蛋白表达潜力也应该是一模一样的。

因此认为不同菌落具有不同表达外源蛋白潜力这种说法显然是经验之谈。

可以多挑几个菌落做后续测试。

(2)因此，无论何种条件下外源蛋白表达出来了，接下去的工作是在-70℃冰箱好好地保存菌种。

(3)IPTG是控制外源基因表达的开关，外源蛋白的表达将占用细菌本身的蛋白合成机器和能量，自身的繁殖将减弱。

在更高OD600时诱导，有更高的生物量，通常可以产生更多的外源蛋白。

但IPTG诱导的时间点并非可以无限地延迟，有的细胞在高OD600时诱导可以达到很好的表达的效果，但有的细胞诱导时机一旦OD600 > 0.5，就不表达外源蛋白。

适中的诱导时间点可以设置OD600 = 0.8。

(4)IPTG浓度？通常不是主要因素。

在0.2mM诱导不出的即使加到1mM也不会出来。

(5)诱导时间要进行测试，诱导之后每隔2hr取样检测。

(6)小体积（<200ml）摸索出来的最佳诱导条件，在大体积中（>1L）经常不适用。

所以每次改变系统，通常要重新来过。

(7)当测试完以上条件，还无法表达出蛋白，那么只能重新构建载体，改造外源基因让其更长或更短，还要重新检查外源基因是否有大肠杆菌不喜欢的密码子。

大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。

2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。

可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。

3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。

4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。

5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。

6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。

在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。

蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。

适用范围蛋白原核表达。

实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。

（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。

（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。

（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。

（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。

（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。

（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。

（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。

（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。

原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。

本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。

1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。

(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。

以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。

5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离⼼管中的⽔倒⼲净。

（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。

⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。

样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。

蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构，也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。

因此，蛋白质的高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。

蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。

原核表达系统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。

在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过转化酵母细胞实现表达。

大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行表达。

相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化和折叠过程。

真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。

例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。

对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。

在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。

而载体的选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和pEF系列载体。

在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。

离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或离子浓度来调节分离效果。

亲和层析则是通过利用蛋白质与其特异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现分离。

最近在做原核表达，包涵体。

以前也做过，但经验不多。

从园子里也学到不少。

一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正。

1. 首先介绍一下背景。

载体是novagen公司的pET22b，Amp 抗性。

菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。

2. 第一次失败。

第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。

PCR、酶切都正确。

但没等测序结果出来就开始做了。

失败了，曾在园子求助。

后来证明是引物错误。

我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。

这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。

教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。

引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。

3. 第二次失败。

后来重新构建、转化、诱导。

第一次诱导时根本就没带。

见附图（图片质量太差了，下面几个帖会逐渐好转）然后开始闷头找原因。

周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。

到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。

一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。

当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。

所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。

转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。

这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。

当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。

这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。

在使用Amp抗性的时候要格外注意。

原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。

本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。

一．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达（一）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp （100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。

(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。

以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。

5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离心管中的水倒干净。

（二）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。

用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。

样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。

原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。

37℃，过夜摇菌。

2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。

（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。

大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。

二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。

根据这个结果选择纯化方法。

（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。

（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。

三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。

4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。

（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。

原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，它在生物学和生物技术领域被广泛应用。

原核表达系统通常包括大肠杆菌、酵母和其他细菌等微生物，其表达效率高、表达周期短、操作简便，因此备受研究者青睐。

然而，由于细胞内含有大量的内源性蛋白和杂质，常规方法无法有效地纯化目标蛋白。

为了解决这一问题，科学家们开发了各种蛋白纯化方法。

其中，镍离子亲和纯化技术因其高选择性和高效性而备受关注。

镍离子亲和纯化的原理是基于镍离子（Ni2+）与某些蛋白的特定结构域（如组织因子蛋白A标签、组织因子蛋白S标签和组织因子蛋白H标签等）之间的特异性配位作用。

通过构建一定的表达载体，将含有目标蛋白的基因与镍离子亲和柱（如Ni-NTA柱）结合，可以实现目标蛋白在细胞裂解液中的高效富集。

在原核表达蛋白镍离子亲和纯化的方法中，首先需要构建包含目标蛋白编码序列的表达载体，并将其转化到适当的宿主细胞中。

然后，通过诱导表达剂（如异丙基β-D-硫代半乳糖苷）刺激蛋白的大量合成。

接着，使用一系列的细胞破碎方法，如超声波处理或高压细胞破碎仪，将细胞内的目标蛋白释放出来。

最后，通过镍离子亲和柱，将目标蛋白与杂质分离，得到纯化的目标蛋白。

镍离子亲和纯化在原核表达蛋白中具有广阔的应用前景。

通过该方法，可以高效地纯化大量的目标蛋白，为后续的结构解析、功能研究和药物开发提供了可靠的材料基础。

然而，该方法也存在一些局限性和可改进之处，例如对于某些难以表达的蛋白，亲和纯化的效率可能较低；此外，在某些情况下，镍离子柱可能与非特异性结合的蛋白相互作用，导致纯化产物的纯度下降。

综上所述，原核表达蛋白镍离子亲和纯化技术是一种高效、可靠的蛋白纯化方法，具有广泛的应用前景。

随着该技术的不断发展和改进，相信将为蛋白研究领域提供更多更好的工具和方法。

文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：第一部分是引言。

原核表达及蛋白质的纯化原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一( 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的。

IPTG浓度为0.8m/mL5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20?贮存。

常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20?贮存。

常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。

加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。

加入650mL的去离子水，均匀搅拌。

用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。

8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。

9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。

10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。

蛋白原核表达预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度1. 构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），挑斑菌液PCR验证。

2. 分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）单菌落至5 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养过夜，即种子菌。

3. 将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养。

4. 待菌液浓度达到OD600为0.6~0.8时（约3 h），加入IPTG至终浓度为1 mM，37 ℃摇床，180 rpm 培养4~6 h。

（最适的诱导浓度、诱导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓度及温度是不同的）5. 取100 μL菌液，12，000 g 离心2 min，弃上清，用40 μL PBS 悬浮菌体，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品A（总蛋白）。

6. 将剩下的20 mL 菌液离心弃上清，加入2 mL PBS悬浮菌液，其中1 mL 菌液备用，另1 mL 菌液转入1.5 mL 离心管中，12，000 g 离心2 min，弃上清，加入800 μL 超声波反应缓冲液，15% ，超声1 s ，间隔2 s ，反应5 min ，4 ℃，12，000 g 离心2 min，取500 μL 上清，在上清样品中取40 μL 上清加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品B（可溶性蛋白）。

7. 沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，用500 μL 裂解缓冲液悬浮沉淀，取40 μL 沉淀，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品C（不可溶蛋白，即包涵体）。

原核表达实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过原核表达系统将目标蛋白在大肠杆菌中进行表达，并对其进行纯化和鉴定。

二、实验材料
1. 目标蛋白基因克隆质粒；
2. 大肠杆菌感受态细胞；
3. 抗生素（如氨苄青霉素）；
4. IPTG诱导剂；
5. SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒；
6. 蛋白质纯化试剂盒。

三、实验步骤
1. 大肠杆菌转化：将目标蛋白基因克隆质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，加入抗生素（如氨苄青霉素）筛选阳性克隆。

2. 诱导表达：将阳性克隆的大肠杆菌接种到含有IPTG诱导剂的培养基中，使其表达目标蛋白。

3. 收集菌体：培养一定时间后，收集大肠杆菌菌体。

4. 裂解菌体：将收集到的大肠杆菌菌体进行裂解，释放目标蛋白。

5. 纯化目标蛋白：使用蛋白质纯化试剂盒对目标蛋白进行纯化。

6. 鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析目标蛋白的表达情况和纯度。

四、实验结果与分析
1. 大肠杆菌转化结果：通过抗生素筛选，获得阳性克隆。

2. 诱导表达结果：在含有IPTG诱导剂的培养基中，目标蛋白得到了有效表达。

3. 菌体收集结果：成功收集到大肠杆菌菌体。

4. 裂解菌体结果：菌体裂解后，释放出目标蛋白。

5. 纯化目标蛋白结果：通过蛋白质纯化试剂盒，成功纯化了目标蛋白。

6. 鉴定目标蛋白结果：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，目标蛋白得到了高纯度的表达。

五、实验结论
本实验通过原核表达系统成功表达了目标蛋白，并通过纯化和鉴定获得了高纯度的目标蛋白。

这为进一步研究该蛋白的功能和应用提供了基础。

His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定表达载体和目的片段的连接一般为10µL连接体系，此步转化方法如下：取100µL DH5α感受态细胞，加入到10µL连接产物体系中↓冰上放置30min↓42℃准确热激90秒↓冰上放置3min↓加入300µL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h↓将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后，在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。

2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rpm/min，37℃培养4h，待菌液浑浊后，取1μL做菌液PCR鉴定。

PCR扩增体系如下：取1 μL菌液作为模板反应体系如下：模板 1 µL10×PCR反应缓冲液（含Mg2+） 2 µLdNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 µL上游引物（10 µmol/L） 1 µL下游引物（10 µmol/L） 1 µLTaq酶（5 U/µL）0.3 µLddH2O 13.1µLTotal 20 µL 条件：94℃预变性10min94℃变性45s50℃退火45s72℃延伸1min，30个循环的扩增反应72℃延伸10 min4℃∞1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样3µL样品（1µL loadingbuffer +6µL PCR产物混匀上样）100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。

（注意：记得保存菌种）3 阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200µL，加3ml含Amp+ LB液体培养基，37℃ 200rpm/min培养3-4h，待菌液浑浊后，进行质粒抽提。