原核蛋白表达常见问题解析

原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

原核大肠杆菌蛋白表达系统是一种常用的表达系统，它基于细菌细胞（通常为大肠杆菌）对外源基因的转录和翻译过程。

在表达载体中，包含有启动子、激活子和选择子等元件，这些元件使得外源基因能够被细菌细胞识别、转录成mRNA，并通过翻译过程合成目标蛋白。

大肠杆菌表达载体的要求如下：
1. 操纵子以及相应的调控序列，因为外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用。

2. SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7\~13bp翻译效率最高。

3. 多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。

此外，目的基因在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因。

原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因含有内含子不能直接表达，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。

同时还需要提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。

以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。

蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。

然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。

本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。

一、蛋白质表达问题解答1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。

首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。

其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。

另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。

2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。

一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。

质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。

另外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。

3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。

SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。

根据实验需求选择合适的方法进行检测。

二、蛋白质纯化问题解答1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。

常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。

根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。

2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。

比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强度，纯度则指的是蛋白质在总样品中所占的比例。

活性蛋白整体方案原核表达系统蛋白表达问题解析摘要：本文主要对原核蛋白表达纯化体系中的常见问题进行收集整理，并附有解决思路和相应的实际操作。

外源DNA片段成功插到载体里面（PCR鉴定），但无法表达蛋白一般判断目的基因是否表达，首先要进行SDS-PAGE检测。

跑胶的时候一定要设对照：Marker，标准品阳性对照，以及空白载体(诱导)和重组载体(不诱导)2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。

跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做western blot了。

银染的灵敏度在0.1～1ng；或是Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western blot。

在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要先判断载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。

其次要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。

最后，也需要注意基因中是否有稀有密码子，可更换表达菌株。

每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。

不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。

采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。

例如，使用BL21(DE3)菌株表达不成功可以尝试用Rosetta系列菌株表达，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。

所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。

有时不明原因的表达蛋白截短(比预期的分子量要小很多)也可能是由于稀有密码子造成的。

没有发现原则性错误之后，可以从表达条件入手，梯度条件改变表达温度、IPTG浓度，低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达；低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。

原核蛋⽩表达常见问题解析原核蛋⽩表达常见问题解析1、为什么⽬的蛋⽩总是以包涵体的形式出现？在原核蛋⽩表达纯化中⽬的蛋⽩经常发⽣错误的折叠，并聚集成为包涵体。

经过诱导，⽬的蛋⽩通常可达细胞总蛋⽩的50%以上。

虽然有⼀定⽐例的蛋⽩以可溶的单体形式存在，⽽多达95%（甚⾄更多）的蛋⽩则在包涵体中。

实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采⽤特别的培养基等⽅法获得更多的可溶蛋⽩。

2、跨膜蛋⽩为什么很难表达？跨膜蛋⽩的表达成功率相对较低是⼀个实验结果，究其原理，⽬前众说纷纭很多种理论。

以我们浅薄的理解层⾯来看，主要有以下⼏个原因：跨膜蛋⽩⼀般都是强疏⽔性的氨基酸分⼦和亲⽔性的分⼦跳跃式的连接，形成的亲⽔疏⽔的⼀个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞⼀样完成信号肽识别及切除、引导内质⽹、⾼尔基体重新包装及分泌这⼀复杂过程，有些蛋⽩是多次跨膜，对于原核细胞来说⼏乎是不可能完成的任务。

另外，对于疏⽔性的⽚段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏⽔性多肽会抑制翻译过程，甚⾄与原核膜结构融合形成毒性，出于⽣物⾃我保护的本能，所有的细胞器都会停⽌合成蛋⽩的过程。

3、如何选择蛋⽩表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋⽩纯化⽅式？如何选择不同的纯化⽅式？答：我们公司的蛋⽩纯化⽅法⼤致分为亲和纯化、离⼦交换、切胶回收三类。

1、常规情况下，⼀般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进⾏亲和纯化获得融合蛋⽩，⽤亲和纯化的⽅法⼀般可以获得85%以上纯度的蛋⽩，亲和纯化的⽅便快捷。

2、如果需要⽬的蛋⽩不含有任何标签，怎么选择纯化⽅式？。

（1）可表达融合蛋⽩，⽤蛋⽩⼯具酶切割融合蛋⽩，再进⾏纯化除去⼯具酶。

此⽅法能快速得到蛋⽩。

（2）可表达不含标签的蛋⽩，进⾏离⼦、分⼦筛、疏⽔等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋⽩。

原核表达本贴非原创，特声明。

PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中到正确的读码。

②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。

在编码区中找到翻译起始密子与终止密码子（cDNA）。

2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CD 是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，parti CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。

是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。

蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。

然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。

本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。

一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。

不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。

常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。

找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。

解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。

对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。

对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。

此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。

二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。

在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。

解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。

分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。

此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。

三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。

然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。

解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。

首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。

其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。

此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。

四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。

原核表达目的蛋白的方法原核表达目的蛋白的方法1. 引言原核表达是一种常用的表达蛋白质的方法，其主要基于原核细胞（如大肠杆菌）的天然表达系统。

通过使用不同的表达载体和相关技术，研究人员可以将目的蛋白质在原核细胞中高效表达，并借此进行产量大、成本低的蛋白质生产。

2. 选择合适的表达载体在原核表达中，选择合适的表达载体是非常重要的。

常见的表达载体有质粒和噬菌体。

质粒表达系统依赖于质粒DNA在细胞内的复制和转录作用，噬菌体表达系统则是通过感染细胞引起的溶菌作用来释放表达产物。

根据需求和实验目的，可以选择适当的表达载体。

3. 选择适当的表达宿主常用的原核表达宿主是大肠杆菌，因其具有较强的表达能力和简单的培养条件。

其他一些菌株如酵母、双歧杆菌等也可以用于原核表达。

根据目的蛋白的特性和表达要求，选择合适的表达宿主。

4. 优化基因序列在进行原核表达之前，需要对目的蛋白的基因序列进行优化。

合成较高优化的核酸序列，包括优化翻译起始子和优化密码子使用。

这样可以提高蛋白质的表达水平和折叠状态。

5. 转化目的蛋白质转化是指将目的蛋白质基因导入表达宿主中的过程。

最常用的方法是通过化学转化或电转化将表达载体导入细胞。

还可以利用病毒、质粒导弹等方法进行转化，具体选择方法取决于实验需求和表达系统。

6. 诱导表达转化后，需要选择适当的诱导方法来激活表达载体中的目的蛋白基因。

常用的诱导剂有异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、丝氨酸酶等。

根据表达宿主和表达载体的不同，可选择不同的诱导浓度和诱导时间。

7. 提取和纯化目的蛋白经过表达和诱导后，目的蛋白质可在细胞内或细胞外表达。

具体提取和纯化方法可以根据蛋白质的特性和需求选择，常用的方法包括离心法、柱层析法、亲和层析法等。

8. 评估表达蛋白质的性质和功能通过一系列生化、免疫学、生物学等实验方法，可以对表达蛋白质的性质和功能进行评估。

可以利用SDS-PAGE检测蛋白质的表达水平和相对分子质量。

原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。

2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。

原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，它在生物学和生物技术领域被广泛应用。

原核表达系统通常包括大肠杆菌、酵母和其他细菌等微生物，其表达效率高、表达周期短、操作简便，因此备受研究者青睐。

然而，由于细胞内含有大量的内源性蛋白和杂质，常规方法无法有效地纯化目标蛋白。

为了解决这一问题，科学家们开发了各种蛋白纯化方法。

其中，镍离子亲和纯化技术因其高选择性和高效性而备受关注。

镍离子亲和纯化的原理是基于镍离子（Ni2+）与某些蛋白的特定结构域（如组织因子蛋白A标签、组织因子蛋白S标签和组织因子蛋白H标签等）之间的特异性配位作用。

通过构建一定的表达载体，将含有目标蛋白的基因与镍离子亲和柱（如Ni-NTA柱）结合，可以实现目标蛋白在细胞裂解液中的高效富集。

在原核表达蛋白镍离子亲和纯化的方法中，首先需要构建包含目标蛋白编码序列的表达载体，并将其转化到适当的宿主细胞中。

然后，通过诱导表达剂（如异丙基β-D-硫代半乳糖苷）刺激蛋白的大量合成。

接着，使用一系列的细胞破碎方法，如超声波处理或高压细胞破碎仪，将细胞内的目标蛋白释放出来。

最后，通过镍离子亲和柱，将目标蛋白与杂质分离，得到纯化的目标蛋白。

镍离子亲和纯化在原核表达蛋白中具有广阔的应用前景。

通过该方法，可以高效地纯化大量的目标蛋白，为后续的结构解析、功能研究和药物开发提供了可靠的材料基础。

然而，该方法也存在一些局限性和可改进之处，例如对于某些难以表达的蛋白，亲和纯化的效率可能较低；此外，在某些情况下，镍离子柱可能与非特异性结合的蛋白相互作用，导致纯化产物的纯度下降。

综上所述，原核表达蛋白镍离子亲和纯化技术是一种高效、可靠的蛋白纯化方法，具有广泛的应用前景。

随着该技术的不断发展和改进，相信将为蛋白研究领域提供更多更好的工具和方法。

文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：第一部分是引言。