原核蛋白表达纯化条件优化方案

原核蛋白的表达、分离和纯化实验原理：携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。

蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤：一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。

3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM2-ME，pH8.0。

4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。

6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

可溶性GST-CRH 蛋白原核表达条件的优化及纯化郁硕1，陈锋2，刘英富3，霍景瑞2，李光宗2，张益2，丁辉2，樊毫军1△摘要：目的通过谷胱甘肽巯基转移酶（GST ）-促肾上腺皮质激素释放激素（CRH ）原核表达条件的优化及纯化，获得可溶性好、纯度高的重组GST-CRH 蛋白。

方法通过对GST-CRH 转化菌表达温度、菌液密度（OD 600）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度以及诱导时间的摸索，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）检测可溶性GST-CRH 蛋白的表达情况，GST 琼脂糖凝胶进行GST-CRH 的纯化，Western Blot 对表达的目的蛋白进一步鉴定。

结果起始OD 6000.8、IPTG 工作浓度0.1mmol/L 、30℃诱导8h 为GST-CRH 最优诱导条件；融合蛋白经Western Blot 鉴定为表达的GST-CRH ，纯化后纯度＞95%。

结论建立了GST-CRH 的原核表达及纯化方法，获得了高纯度的GST-CRH 可溶性蛋白。

关键词：促肾上腺皮质素释放激素；谷胱甘肽巯基转移酶；原核表达；纯化中图分类号：R392-33文献标志码：ADOI ：10.11958/20161302Optimization of prokaryotic expression condition and purification of soluble GST-CRH proteinYU Shuo 1,CHEN Feng 2,LIU Ying-fu 3,HUO Jing-rui 2,LI Guang-zong 2,ZHANG Yi 2,DING Hui 2,FAN Hao-jun 1△1Respiratory Department,the Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Henan 453000,China;2Institute for Disaster and Emergency Rescue Medicine,the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People ’s Armed PoliceForce;3Department of Cell Biology,Logistics University of Chinese People ’s Armed Police Force△Corresponding Author E-mail:fanhaojun999@Abstract:Objective To obtain the recombinant corticotropin releasing hormone (CRH)protein with soluble,highpurity protein through optimizing prokaryotic expression condition and purifying glutathione thiol transferase (GST)-CRH protein.MethodsTo detect the expression of soluble CRH protein through grope of the host strain GST-CRH temperatureof induction expression,the host strain concentration (OD 600),IPTG concentration and induction time,the purification of GST-CRH was performed by GST-CRH agarose gel.Western Blot assay was used for the expression identification of the target protein.ResultsThe optimal conditions for the induction of CRH protein were determined:temperature of 30℃,IPTG induced concentration 0.1mmol/L,bacteria density (OD 600)0.8,the induction time of 8hours,purified GST-CRH >95%fusion protein was obtained.ConclusionThe optimal expression conditions of GST-CRH are obtained,and thesoluble protein of high purity GST-CRH is also obtained.Key words:corticotropin-releasing hormone;glutathione s-transferase;prokaryotic expression;purification基金项目：天津市科技计划项目（14ZCDZSY00033）；全军重点实验室开放基金（JY1402）；武警后勤学院附属医院科研平台开放基金（WYFKFM201602、WYKFZ201603）作者单位：1河南新乡医学院附属医院呼吸内科（邮编453000）；2武警后勤学院附属医院救援医学研究所；3武警后勤学院细胞生物学教研室作者简介：郁硕（1988），男，硕士，住院医师，主要从事呼吸与危重症专业方面的研究△通讯作者E-mail ：fanhaojun999@促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasing hormone ，CRH ）能够刺激垂体促肾上腺皮质激素的释放［1］，是下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要调节者［2］，在应激反应中发挥着重要的调节作用。

【专题讨论】原核表达条件优化！会不会是蛋白质的表达量低，电泳并不能反映出来，典型的例子是干扰素，虽然电泳没有新生条带，但是裂解上清的活性却很高。

“疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白，42度发酵，可抑制宿主菌蛋白表达疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白?那条带也挂在亲合柱子上的，发酵的细菌蛋白却没有。

挂在亲合柱子上,也有可能是非特异性条带，如用HIS TAG亲合柱，加大米错量试一下。

胞内表达有生物活性蛋白的一些策略包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。

有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（14）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。

胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。

这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如DsbA/DsbB难以正确折叠。

有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的TrxB基因失活以及造成一定的还原势。

硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。

这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。

Novagen公司pET宿主菌系列中的AD494（DE3）和Origami B(DE3)都是TrxB基因突变菌株。

原核蛋白可溶性表达策略及实验方案可溶性表达策略大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。

这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。

因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。

有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。

降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。

高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。

因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。

常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。

密码子优化密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。

密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。

经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。

值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。

启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。

在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。

若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。

原核表达条件优化E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。

由于V ector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。

本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。

pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。

ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。

而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。

功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。

缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。

表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。

【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。

这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。

本实验证实约60%以上的细菌无质粒。

鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。

原核表达系统三大要素的选择及优化(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

麻疹病毒N蛋白原核表达纯化条件的优化侯丹丹;王云龙;张怡青;孙新城;李玉林;米海;王继创;程蕾【摘要】通过构建重组表达质粒，诱导表达纯化麻疹病毒 N 蛋白．将麻疹病毒 N 蛋白基因片段与载体pET -32a（＋）相连接，通过 PCR 方法扩增获得重组质粒pET -32a（＋）/N，然后将重组质粒转入大肠杆菌 E．coli BL21（DE3）内，并优化诱导表达时间、温度、诱导剂浓度等条件．SDS -PAGE 和 West-ern blot 蛋白印迹检测表明，麻疹病毒 N 蛋白分子质量约为60 kD，表达产物用 Ni -NTA 亲和层析和DEAE 纯化后，纯度达90％．%In order to construct a recombinant expression plasmid which induced express purification mea-slesvirus(MV)N protein,the recombinant plamised of pET-32 a (+)/N amplified by PCR from MV N protein genes was inserted into expression vector pET-32 a (+),then it was transformed into E.coli BL21 (DE3).The condition of time,temperature and concentration of IPTG were optimized.The results of SDS-PAGE and Western blot tests showed that MV N protein molecular was 60 kD.The prot ein′s purity was 90% after being purified by Ni-NTA and DEAE.【期刊名称】《郑州轻工业学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(000)006【总页数】4页(P32-34,47)【关键词】麻疹病毒;核壳蛋白;原核表达;蛋白纯化【作者】侯丹丹;王云龙;张怡青;孙新城;李玉林;米海;王继创;程蕾【作者单位】河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007;河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007;河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007;郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001;河南省生物工程技术研究中心，河南郑州 450001【正文语种】中文【中图分类】Q786.4麻疹是一种高度传染的呼吸道疾病，具有典型的临床症状，包括斑丘疹、发热、咳嗽、鼻炎和结膜炎.麻疹病毒是麻疹的病原体，分类上属于副黏病毒科麻疹病毒属.麻疹病毒可以划分为8个基因组(A—H)，21个基因型，核壳蛋白(N蛋白)是麻疹病毒的主要抗原，可产生中和(Nt)抗体.在研究基因工程麻疹疫苗中，N蛋白基因是首选的病毒抗原［1］，它是麻疹病毒颗粒中含量最多的蛋白，并且是麻疹病毒在繁殖和转录过程中第一个被合成的蛋白，一般由525个氨基酸残基组成，分子量为60 kD.N蛋白主要是以磷酸化的形式存在，并同病毒的RNA结合形成多聚复合物，该复合物表现相当稳定，可以抵抗高盐的环境.当前利用基因工程方法表达麻疹病毒蛋白已有不少报道［2-5］.N蛋白诱导表达主要采用载体pET-28a(+)并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行，通过Ni-NTA亲和层析获得的高纯度目的蛋白用于ELISA检测.本实验拟选择麻疹病毒N蛋白基因片段，构建原核表达载体，以期经诱导表达和纯化，获得目的蛋白.1.1 材料1.1.1 质粒和宿主菌 pUC19/N由河南省生物工程技术研究中心提供;载体pET-32a(+)，购自Novagen公司;E.coli BL21(DE3)大肠杆菌菌株由本实验室保存.1.1.2 引物的设计依据表达质粒和N蛋白基因编码区设计引物，上游引物5'—CGCGGATCCATGTTGGAGGTTGTCCAG—3'(含BamHⅠ酶切位点)，下游引物5'— CCCAAGCTTCTAGTCTAGAAGGTCTCT—3'(含XhoⅠ酶切位点)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.1.1.3 主要试剂BamHⅠ，HindⅢ限制性内切酶，T4 DNALigase连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA胶回收试剂盒、异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司.1.2 方法1.2.1 重组质粒pET－32a(+)/N载体构建及转化 1)依据N蛋白基因编码区设计引物，建立30 μL PCR反应体系(20×buffer，1.5 μL;MgCl2，0.3 μL;dNTP，0.3μL;上游引物，0.2 μL;下游引物，0.2 μL;DNA聚合酶，0.3 μL;模板，0.5 μL;ddH2O，4 μL)扩增目的基因片段，扩增产物与pET-32a(+)载体经BamHⅠ，XhoⅠ双酶切后，由T4 DNA连接酶连接双酶切产物而构建重组质粒pET-32a(+)/N;2)将质粒转入宿主细胞大肠杆菌中，接种于1 mL LB液体培养基中，37℃摇床培养1 h，然后取菌液50 μL转接于3.5 mL LB(含Amp 30 mg/mL)液体培养基中，培养至OD600约为0.3～0.5，加IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，诱导表达5 h，分别进行12%SDS—PAGE分析;3)将表达菌送上海生物工程技术服务有限公司测序.1.2.2 重组菌的小样诱导表达及条件的优化1)温度诱导:在IPTG浓度为0.2mmol/L下，分别于30℃，37℃和42℃诱导表达5 h.2)IPTG浓度诱导:在37℃，IPTG浓度分别为0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.5 mmol/L，1.0 mmol/L，2.0 mmol/L，诱导表达5 h.3)时间诱导:在IPTG浓度为0.2 mmol/L，37℃条件下，分别诱导3 h，4 h，5 h，6 h，7 h，8 h.取表达产物各1 mL以1 000 r/min破碎离心5 min，离心后取上清进行12%SDS-PAGE分析.1.2.3 重组菌大样的诱导表达按小样最佳诱导条件，取表达稳定的菌液1 mL接于1 000 mL LB液体培养基(含Amp 30 mg/mL)，进行大样诱导表达，收集菌液，4 500 r/min离心15 min，弃上清，加入0.05 mol/L PB洗涤沉淀，再次离心后收集沉淀.1.2.4 N蛋白的纯化及Western blot蛋白印迹验证将收集的沉淀用0.05 mol/L PB(pH=7.8)溶解，在冰浴条件下超声破碎，将破碎的菌液8 000 r/ min离心15 min，取上清过Ni-NTA亲和层析柱和DEAE柱纯化，Western blot蛋白印迹验证.2.1 N蛋白基因的克隆及pET－32a(+)/N表达载体构建PCR产物电泳结果见图1，在1 452 bp左右有一条目的带，与测序结果相符.诱导表达结果见图2，与BL21空菌和未诱导重组菌相比，上清中约在60 kD处有目的条带，大小与预期值相符.测序结果表明表达菌含N蛋白基因片段，即重组质粒构建成功.2.2 目的蛋白的表达及条件的优化温度梯度诱导结果见图3，37℃表达量最大; IPTG梯度诱导结果见图4，IPTG浓度为0.2 mmol/L时最优;时间梯度诱导结果见图5，4 h时菌体表达量最优.综上可知，37℃，IPTG浓度为0.2 mmol/L，诱导4 h条件下，目的蛋白的表达结果最佳.2.3 目的蛋白的纯化及Western blot蛋白印迹验证目的蛋白经Ni柱和DEAE纯化后SDS-PAGE检测结果见图6.Western blot免疫印迹结果见图7.纯化后蛋白浓度的测定结果为A280=2.704，根据标准N蛋白吸光度值与蛋白浓度之间的转换关系，A =0.963时相当于蛋白浓度为1.0 mg/mL，可粗略计算出所纯化的N蛋白浓度约为3.0 mg/mL，最终收集纯化后N蛋白的体积约为35 mL，Ni柱亲和层析纯化所得蛋白质量约为105 mg.由图7可见，纯化后的麻疹N蛋白与相应抗体产生特异性反应，证明该蛋白有较好的抗原性.本研究将麻疹病毒核壳蛋白基因导入到大肠杆菌中，选择pET-32a(+)载体，得到重组表达质粒pET-32a(+)/N.同时对温度、时间、诱导剂浓度等诱导条件进行优化.实验发现，在温度37℃，诱导时间4 h，IPTG浓度0.2 mmol/L的条件下目的蛋白表达量最高.选择Ni2+配体亲和层析和DEAE柱纯化后，蛋白纯度高达90%.此蛋白表达纯化系统的建立和优化将会对MV病毒N蛋白的纯化和进一步探讨其功能提供依据.【相关文献】［1］马雷钧，陈志慧.麻疹病毒流行株主要结构蛋白的基因变化［J］.国外医学预防诊断治疗用生物制品分册，2002，25:6.［2］王伟，王海梅.RT-PCR法检测尿液标本中麻疹病毒核蛋白(N)基因的临床应用及意义［J］.山西医科大学学报，2012，43(12):118.［3］ Sousa E，Agudelo-Suárez A，Benavides F G，et al.ITSAL project:Immigration，work and health in Spain:the influence of legal status and employment contract on reported health indicators［J］.Publ Health，2010，55(5):443.［4］陈寅，卢亦愚.麻疹核蛋白基因的表达及检测应用的研究［J］.中国卫生检验杂志，2009，19(5):123.［5］ Willen S.How is health-related“deservingness”reckoned? Perspectives from unauthorized immigrants in Tel Aviv［J］.Soc Sci Med，2012，74(6):812.。

蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构，也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。

因此，蛋白质的高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。

蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。

原核表达系统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。

在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过转化酵母细胞实现表达。

大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行表达。

相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化和折叠过程。

真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。

例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。

对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。

在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。

而载体的选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和pEF系列载体。

在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。

离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或离子浓度来调节分离效果。

亲和层析则是通过利用蛋白质与其特异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现分离。

原核表达条件优化【专题讨论】原核表达条件优化！之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。

Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。

已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。

Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。

pET 系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。

T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。

T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。

并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。

从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。

如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。

根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。

原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。

蛋白的原核表达及纯化方法小伙伴们！今天咱就来唠唠蛋白的原核表达及纯化这事儿。

这在生物实验领域可是个挺重要的活儿呢，好多研究都得靠它。

下面咱就细细说说具体的方法哈。

一、原核表达系统的选择。

咱得先挑个合适的原核表达系统呀。

常用的原核表达系统有大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统啥的。

大肠杆菌表达系统那可是相当受欢迎的，为啥呢？因为它培养简单、生长快、成本还低。

就像咱平常过日子，当然得选那种既方便又实惠的方式啦。

不过呢，不同的蛋白可能对表达系统有不同的要求，所以得根据咱要表达的蛋白的特点来选哦。

比如说，有些蛋白可能在大肠杆菌里表达会形成包涵体，这时候可能就得考虑其他系统啦。

二、表达载体的构建。

选好了表达系统，接下来就得构建表达载体啦。

这就好比给蛋白搭个“房子”，让它能在里面好好“住”下来，顺利表达。

一般咱得先把目的基因克隆到合适的载体上。

这个过程就需要用到一些酶啦，像限制性内切酶，它就像一把“小剪刀”，能把基因片段给剪下来，然后再用DNA连接酶把它接到载体上，就像用胶水把东西粘起来一样。

而且呀，载体上还得有一些调控元件，像启动子、终止子这些，它们就像是房子里的各种设施，能保证蛋白的表达顺利进行。

启动子能启动基因的转录，终止子能让转录在合适的地方停下来，不然就乱套啦。

三、蛋白的诱导表达。

载体构建好了，就该让蛋白开始表达啦。

这时候就需要诱导啦。

不同的表达系统诱导的方法不太一样哦。

就拿大肠杆菌来说吧，常用的诱导剂是IPTG。

当咱把IPTG 加到培养体系里的时候，就像是给蛋白发了个“信号”，告诉它：“该开始干活啦！”然后蛋白就会按照咱设计的路线开始表达啦。

不过呢，诱导的条件也得好好摸索一下，像诱导的时间、诱导剂的浓度这些，都可能会影响蛋白的表达量和活性哦。

要是诱导时间太短，蛋白可能还没表达够呢；要是时间太长，又可能会对蛋白的质量有影响。

四、蛋白的纯化。

蛋白表达出来了，可里面还混着好多其他乱七八糟的东西呢，这时候就得把蛋白给纯化出来啦。

原核表达及蛋白质的纯化原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一( 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的。

IPTG浓度为0.8m/mL5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20?贮存。

常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

分装成小份于-20?贮存。

常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。

加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。

加入650mL的去离子水，均匀搅拌。

用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。

8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。

9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。

10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。

蛋白原核表达预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度1. 构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），挑斑菌液PCR验证。

2. 分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）单菌落至5 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养过夜，即种子菌。

3. 将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养。

4. 待菌液浓度达到OD600为0.6~0.8时（约3 h），加入IPTG至终浓度为1 mM，37 ℃摇床，180 rpm 培养4~6 h。

（最适的诱导浓度、诱导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓度及温度是不同的）5. 取100 μL菌液，12，000 g 离心2 min，弃上清，用40 μL PBS 悬浮菌体，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品A（总蛋白）。

6. 将剩下的20 mL 菌液离心弃上清，加入2 mL PBS悬浮菌液，其中1 mL 菌液备用，另1 mL 菌液转入1.5 mL 离心管中，12，000 g 离心2 min，弃上清，加入800 μL 超声波反应缓冲液，15% ，超声1 s ，间隔2 s ，反应5 min ，4 ℃，12，000 g 离心2 min，取500 μL 上清，在上清样品中取40 μL 上清加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品B（可溶性蛋白）。

7. 沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，用500 μL 裂解缓冲液悬浮沉淀，取40 μL 沉淀，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品C（不可溶蛋白，即包涵体）。