血浆IgG的分离_纯化及鉴定实验报告
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血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告
一、实验目的
掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。
二、实验原理
1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。
2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。
3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。即称为该蛋白质盐析的饱和度。
4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：
在蛋白质要求达到50%以下时采用：
V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）
V0－－蛋白质溶液的原始体积
C1－－所要达到硫酸铵饱和度
C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度
三、试剂与仪器
饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液
四、实验步骤
1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）
2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。
3.将所有的沉淀再溶于5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液后。滴加饱和硫酸铵溶液2.7ml，使其饱和度达到35%，加完后，4度放置20min，以3000r/min离心15min，上清液弃去，即制得粗制的IgG沉淀。
4.将上沉淀溶解于1ml0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液中。摇匀，然后配制成10mg/ml的IgG溶液1ml。
5.将配制好的gG溶液滴加到凝胶中进行电泳。
五、实验结果
所得gG沉淀为123.5mg
凝胶电泳分成5个区带。
标准的电泳分离是形成10个区带，由于IgG蛋白质在一系列的操作过程后，硫键会断裂，形成两个大亚基各两个小亚基，由于大亚基分子量较大，在电泳过程中所受阻力也就大，相反小亚基分子量小，阻力小，所以小亚基电泳时速率要比大亚基大。
由于实验中的凝胶图像可以看出，在标准电泳分离参照下，在40~55KB分子量间出现一条狭窄的区带，由于大亚基是50KB，所以可以推测出所得到的在40~50KB间的区带是大亚基的区带，由图像可以看得出区带狭窄清晰，说明所得蛋白质比较纯，杂蛋白少，电泳分离效果好。同样，在25~35KB间亦出现一条区带，但这条区较宽，且不太清晰。由于小亚基是27KB，所以此区带可以推测出是小亚基，由于小亚基分离时，速度比较快，得到区带也就比较宽，且电泳时间不足，凝胶造成了观察的不清晰，另外，电泳时，小亚基相对不是很集中，也造成了不清晰。
六、思考题
1.什么叫分级盐析？本实验中是如何采取分级盐析获得IgG粗品的？
答：各种蛋白质盐析出来所需的盐浓度各异，通过控制盐的浓度，使蛋白质混合中的各成分分布盐析出来，达到分离目的蛋白质，称为分级盐析。
本实验：通过先向溶液中加入2.5ml，使纤维蛋白形成沉淀析出，取上层溶液，再加入盐溶液，使其饱和度达到50%，除去上清液蛋白，取沉淀加入盐溶液，使其饱和度达到35%，分离出现沉淀为球蛋白，除去上清液α，β球蛋白。
2.PAGE时样品中加入少量溴酚蓝和40%蔗糖溶液作用是什么？
答：溴酚蓝作用：溴酚蓝本身具有负电荷，分子量比小，摩擦力不大，其迁移速度信息论快，在电泳过程中一直处于领先地位，这样用溴酚蓝等示踪颜料，可以观察蛋白质的电泳情况，使样品没有泳动出来的情况。
40%蔗粉作用：在电泳过程中，缓冲溶液易于扩散分散开来，加入庶粉，可以防止蛋白质样品在溶液中扩散，提高了蛋白质的密度。
3.根据实验过程的体会，总结如何做好该综合性实验？在实验中哪些是关键性步骤？
答：总结：要做好该实验：1、课前预习，掌握实验过程大概操作，避免因实验的不连续或读题造成影响；2、预前的物质准备，试剂的准确配制是实验的重点之一，配制时，要用分析天平称量，使误差减至最少；另外，缓冲溶液的PH也要测定清楚；3、实验操作规范，标准的操作，是实验成功的保证；4、团体合作，实验过程中需要队员的合作，正如不怕神一样的对手，就怕猪一样的队友。
关键步骤：1、盐析过程中，滴定盐溶液，达到其所需要的饱和度。2、电泳过程中，凝胶板的形成过程，及滴加样液都是关键步骤。
