小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法

小鼠内皮祖细胞的分离、培养和鉴定一、小鼠外周循环血的采集⑴材料：穿刺针- 6号注射针头，1ml注射器（麻醉用），解剖板、无菌离心管，消毒酒精，外科剪刀，止血钳，镊子，无菌纱布若干，10％水合氯醛，肝素。

⑵方法：腹主动脉穿刺采血法①健康的昆明小鼠，20-25g，经腹腔注射10％水合氯醛(0.3mL／100g)麻醉5分钟，无菌条件下将大鼠仰卧固定于手术台上，酒精消毒皮肤后,沿腹中线自耻骨上至胸骨下剪开皮肤与腹膜。

②在切口两端向左右各横剪一刀,直达腹侧壁,将腹壁翻向左右两侧,充分暴露腹腔。

术者用右手食指自左向右轻轻推移肠管显露出腹后壁,清除腹膜后脂肪组织,即可于脊柱前清晰见到腹主动脉与腹主静脉。

③仔细辨识腹主动脉（色粉红、有光泽、较细）分成左右骼动脉处,在此分叉处之向心端处为最佳穿刺点。

④持穿刺针朝向心端方向刺入,入针角度约30°，深度5mm左右,当阻力骤减时, 以预先用肝素湿润过的无菌注射器抽吸血液，然后移入预先以肝素湿润过的无菌离心管中.⑶操作技巧：①麻醉过深取血过程中心跳可能停止,会减少血量；过浅,动物躁动影响操作,此时可放乙醚棉球在其口鼻处作补充麻醉。

②穿刺针尖斜面朝下,进针迅速,否则会有血液溅出。

若穿透动脉或穿刺针脱出,可用止血钳夹住动脉,以纱布吸尽视野血液后,沿向心端移数毫米,再行穿刺。

二、EPC的分离和培养⑴材料：①试剂：1×PBS液, 小鼠淋巴细胞分离液（Histopaque-1083-1， sigma 公司),M199培养基（Hyclone公司），纤维连接蛋白（北京博奥森生物技术有限公司）。

②预先准备：无菌移液管、微量加样器，离心管、毛细管、培养皿，常温离心机，计数板，培养皿，倒置显微镜。

⑵方法：密度梯度离心法①在收集的外周循环血中加入等量1×PBS液混匀，使之成为单个核细胞悬液，准备好一支含3ml Histopaque-1083-1液的容积为15ml的无菌离心管（也可以2：3比例加入，须实验时具体尝试），将单个核细胞悬液缓缓平铺在分离液上。

一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。

以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。

- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。

- 取下小鼠/大鼠的皮肤。

使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。

3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。

- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。

- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。

- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。

定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。

4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。

- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。

一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。

- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。

这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。

通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。

肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）分离培养及鉴定的试验方案【试验原理】在用循环灌注法去除肝胶原组织后,根据HSC内含富含脂滴,密度较轻,它与肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理,采用密度梯度离心方法(连续性和非连续性两种)使HSC存在于一高度提纯的区带中而得以分离。

【试验动物】雄性清洁级Sprague-Dawsey大鼠（购自浙江省实验动物中心,合格证号：）,体重400～500g,常规饲料喂养,正常饮水,在分离HSCs前2周每天Vitamin A以200IU/100g灌胃。

【试剂与仪器】主要试剂Ⅳ型胶原酶、链霉蛋白酶(Pronase E)、Nycodenz均为美国Sigma公司产品,DNA酶I(Dnase I)、DMEM培养干粉(高糖型)为Gibco公司产品,鼠抗人Desmin抗体SP试剂盒为福州迈新生物工程公司产品,其它试剂均为国产分析纯试剂。

主要仪器设备蠕动恒流泵、超净工作台(2台)、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化碳培养箱、多功能动物手术台等。

【试验方法】1、肝星状细胞的分离制备1）肝星状细胞的分离采用改良的Friedman方法,大鼠术前禁食12～16h,自由饮水。

2）用1％戊巴比妥钠40mg/kg 腹腔内注射麻醉大鼠。

3）胸腹部皮肤消毒,移入超净工作台中。

沿腹部正中线剪开腹腔,分离下腔静脉及门静脉,在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口,迅速插入自制血管插管,结扎固定。

4）接通恒流蠕动泵,灌注预热37℃的D-Hank’s肝脏灌流液,剪开下腔静脉,此时可见灌流液自下腔静脉流出,肝脏逐渐饱满,由紫红色逐渐变成淡黄白色。

5）游离肝脏,保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。

将游离之肝脏置于平皿中,灌注预热37℃的含酶Hank’s液I(含0.05％的胶原酶、0.1),并将灌注系统进液端放入平皿中,使流出的酶液可进行循环灌流,可见肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡。

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨【摘要】目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。

方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。

结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。

结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。

【关键词】肝；枯否细胞；离心法，梯密度；小鼠，近交BABLc ；细胞分离肝Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。

肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。

近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。

如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。

而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。

本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。

试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。

1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES （美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI��1640培养基（美国Gibco公司）。

小鼠HSCs 的分离1) 实验前准备：37℃水浴锅内预热D-HanK’s溶液、HBSS溶液(含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶)及含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶和20 μg/mL 的DNA 酶的HBSS 溶液；2) 小鼠准备：取体重约25~30 g 的雌性Colgalt2-/-小鼠与Colgalt2+/+小鼠，禁食12 h，自由饮水；3) 麻醉与固定：腹腔注射8‰的戊巴比妥钠麻醉小鼠，麻醉后固定在超净台内，75%乙醇消毒腹部；4) 依次切开小鼠皮肤、腹膜后暴露腹腔，将小鼠胃肠移至腹部左侧，充分暴露门静脉和下腔静脉。

整个过程均按照手术无菌原则执行；5) 自门静脉远端刺入静脉输液针，另一端连接50 mL 注射器，注射预热的D-HanK’s 液。

确定插入成功后，剪开下腔静脉。

以7-10 mL/min 的速度灌注D-HanK’s 液，灌注约30 mL。

观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’s液中无肉眼可见血液后停止灌注；6) 开始灌注预热的含IV 型胶原蛋白酶的HBSS 溶液，速度为3-5 mL/min，灌注10 min 左右。

直至肝脏变软、变脆，肝脏表面呈现裂隙状，压之凹陷不易恢复时结束灌注；7) 摘除胆囊后，剪断门管区韧带和镰状韧带，取下肝脏，放入无菌平皿中。

生理盐水冲洗，剔除肝包膜、血管及纤维结缔组织；8) 剪碎肝组织及震荡消化：将肝组织剪成小碎块，加入已配制好的HBSS液20 mL(含0.3 mg/mL的IV 型胶原酶和1 μg/mL的DNAase I)，37 ℃条件下震荡消化25 min；9) 用200 钼的滤网过滤，1500 g 离心7 min，弃上清；10) 20 mL 冰的不含FBS 的DMEM 培养基将细胞重悬，500 g 离心5 min。

弃去沉淀，即去除肝细胞；11) 离心上清液，1500 g，7 min，吸取沉淀（即肝非实质细胞）；12) 加入2 倍体积的18%Nycodenz离心液，混匀后，小心加入冷的不含FBS的DMEM (约2 mL)；13) 离心：2600 g，22 min。

一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程小鼠肝脏是重要的免疫细胞来源地之一，其免疫细胞种类繁多，包括各类淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

因此，高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞对于免疫学研究具有重要意义。

下面将介绍一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程。

一、试验动物的选取首先需要选择健康的小鼠作为实验动物。

通常可以选择8-12周龄、体重20-25g的小鼠进行实验。

此外，实验前需要确保小鼠处于良好的生理状态，无任何疾病或感染。

二、材料准备1.小鼠静脉采血脉管采血针及离心管2.无菌手术器械3.生理盐水4.乙醚5. 70%乙醇6.无菌培养皿和离心管三、操作步骤1.术前准备将实验所需材料进行无菌处理，保证操作环境无菌。

2.麻醉利用乙醚对小鼠进行麻醉，待小鼠完全麻醉后，进行下一步操作。

3.打开腹腔将小鼠放在无菌操作台上，采用无菌手术器械进行皮肤消毒和切开小鼠腹腔。

4.采集肝脏在麻醉状态下，将小鼠的肝脏从腹腔中取出放入无菌盛皿中。

5.分离肝脏细胞将取出的小鼠肝脏放入含有生理盐水的离心管中，用离心机进行离心，将肝脏中的细胞分离出来。

6.细胞培养取出离心管中的肝脏细胞，放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，进行培养。

7.细胞鉴定通过显微镜检查培养后的细胞，进行鉴定和分析。

通过以上步骤，就可以高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞。

这种方法不仅简单易行，而且获取到的免疫细胞种类繁多，可用于免疫学研究中的各种实验。

在操作过程中，需要严格遵守无菌操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。

同时，也需要尽量减少对小鼠的伤害和痛苦，符合动物实验伦理要求。

希望这种方法能对相关研究工作提供帮助，推动免疫学领域的进步。

小鼠肝细胞原代培养实验一、实验材料准备1. 动物：小鼠。

2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM 培养基、胰酶、PBS 。

3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。

4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

二、方法1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS 的平皿中。

2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS 液的平皿中。

实验方法原理将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA ）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

实验材料小鼠试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM 培养基胰酶PBS仪器、耗材饭盒纱布剪子镊子烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6孔培养板吸管移液管手套微量加样器2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。

4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7. 再次离心5 min，弃上清液。

8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。

10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

内皮细胞成管实验步骤内皮细胞是一种具有重要生物学功能的细胞类型，其在血管形成和维持血管功能方面起着关键作用。

内皮细胞成管实验是一种常用的实验方法，用于研究内皮细胞的管腔形成能力和血管生成的机制。

下面将介绍内皮细胞成管实验的详细步骤。

步骤一：细胞培养和准备1.1 培养内皮细胞：从小鼠或人的血管组织中分离内皮细胞，并将其培养在含有内皮细胞培养基的培养皿中，细胞密度一般为1×10^4 - 1×10^5个细胞/ml。

1.2 细胞的准备：用内皮细胞培养基洗涤细胞，将细胞悬浮于含有血清的培养基中。

步骤二：细胞的涂层和培养2.1 准备基质涂层：在培养皿中加入适量的基质涂层溶液（如胶原、玻璃纤维基质等），在室温下静置1小时或在4°C下静置过夜。

2.2 细胞的涂层：将细胞悬液加入基质涂层的培养皿中，使细胞均匀分布在涂层表面。

2.3 培养细胞：将培养皿放入细胞培养箱中，以37°C、5% CO2的条件下培养。

步骤三：细胞的处理和观察3.1 添加适当的刺激物：在培养基中加入适当的刺激物（如VEGF、FGF等），以促进内皮细胞的管腔形成。

3.2 处理时间的控制：根据实验的需要，控制细胞处理的时间，通常为24-72小时。

3.3 细胞的观察：使用光学显微镜观察培养皿中的细胞形态变化，特别注意细胞的管腔形成情况。

步骤四：结果分析和图像获取4.1 细胞成管评价：根据观察到的管腔形成情况，使用成管指数等评价指标对细胞成管能力进行定量分析。

4.2 图像获取：使用显微镜和成像设备获取细胞成管的图像，用于结果展示和进一步分析。

步骤五：数据分析和结果呈现5.1 数据的统计分析：使用合适的统计学方法对实验结果进行分析，比较不同处理组之间的差异。

5.2 结果的呈现：将实验结果以表格、图表或图片的形式进行呈现，准确描述实验结果和得出的结论。

内皮细胞成管实验是研究内皮细胞生物学功能的重要方法之一。

通过对内皮细胞的培养、处理和观察，可以深入了解内皮细胞的管腔形成过程和相关的信号通路。

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。

1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。

1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。

2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。

5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。

待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。

1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。