大鼠取材方案

大鼠肾脏冰冻切片的体会【中图分类号】R５８７．２【文献标识码】B【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８５７－０１０．引言由于肾脏组织质地柔软,含水量高,或在取材过程中肾组织与水分接触, 突遇低温,易形成冰晶,快速冷冻切片的制作难度大,我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片,总结经验如下. １材料使用德国产Leica—CM１９５０型冰冻切片机,Leica一次性刀片,冷冻组织包埋剂(O．C．T．),AF固定液,改良Gill苏木素染色液,２％碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精,中性树胶. ２方法２．１取材及包埋２．１．１取新鲜大鼠肾脏标本常规取材,标本要新鲜,无需固定,严禁浸入甲醛, 酒精,生理盐水等液,尤其是不可以用酒精固定,酒精固定后组织将无法冷冻.２．１．２将样本托放入冰冻切片机的冻台上预冷,加少许O．C．T．,在OCT 未完全冻结前快速的将组织放于样本托上,在组织周围适量的补充O．C．T,待包埋剂约１/３未冻结时压上冷冻锤,打开加强冷冻,使组织快速冷冻.２．１．３冰冻切片机温度设定在－１６oC—－１８oC为宜.冷冻时间一般为１min~２min.冷冻时间过长,组织易变硬变脆,细胞结构会发生改变,难于切片.２．１．４包埋组织时应将组织周边多留出O．C．T．用于牵引展开切片,O．C．T．中的小气泡应尽量去除,以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果. ２．２切片组织切片厚度设定为５um－６um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗,以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎,在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片.２．３固定切片后立即放入AF固定液固定３０s—１min,不可待切片干后再固定,这样会造成细胞核染色质不清晰,呈现毛玻璃样改变,细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象. ２．４染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色３０s—５０s,经１％盐酸分化,２％碳酸氢钠水溶液返蓝,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 制好的切片核浆对比分明,红蓝适度,颜色鲜艳,达到理想染色效果.３讨论与分析:３．１冰晶是由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构,在组织冷冻过程中,组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生,最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O．C．T．凝固６０％~７０％时,再将冻锤轻压在组织上, 这样既能防止冰晶的产生,又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中２s－３s,待组织冻至８０％时即可取出制片,否则过冻会引起组织发脆,冻头与组织分离[２]. ３．２将包埋剂放入－１０OC或－４OC冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代,因OCT的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出,减少冰晶形成.３．３冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比,取材时组织块尽可能薄,０．２cm 为宜,扁平状冷冻速度快,切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多,切片不能求快,而要确保切片质量,力争一次完成一张高质量的切片[１]. ３．４可预先做好OCT冻头,将冻头上的OCT 修平,有利于将组织放平,再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温,避免组织复温,减少冰晶形成. ３．５肾脏冰冻制片时易产生不规则裂痕,与切片时温度和切片速度有关,操作时应注意操作窗不要开太大,免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱褶,滴加OCT时要上下俩端多,俩侧少,同时要注意OCT不要有小气泡. ３．６冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作,仪器要定期维护,除霜,清洁消毒.总之,冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一,也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验[３]在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用.参考文献[１]陈乐真,徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴１版北京:科学技术文献出版社,２００５:２(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[２]范慧,陈立华,刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析．诊断病理学杂志,２００８,１３８(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[３]吴艳霞．冰冻切片的制作方法分析．吉林医学,２００９,３０(６):４９３．。

一、实验目的1. 掌握大鼠灌注固定技术操作步骤。

2. 观察灌注固定后大鼠组织器官的结构变化。

3. 分析灌注固定过程中可能出现的问题及解决方法。

二、实验材料1. 实验动物：健康成年大鼠，体重200-250g。

2. 实验仪器：手术器械、手术显微镜、注射器、输液器、灌注针、剪刀、血管钳等。

3. 实验试剂：4%多聚甲醛固定液、生理盐水、注射用无菌注射用水等。

三、实验方法1. 动物处死：采用过量麻醉剂使大鼠处死，确保动物在处死过程中无痛苦。

2. 灌注固定：按照以下步骤进行大鼠灌注固定：（1）准备灌注液：将4%多聚甲醛固定液加入500ml输液用玻璃瓶中，加入适量生理盐水，搅拌均匀。

（2）解剖：在手术显微镜下解剖大鼠，暴露心脏。

（3）穿刺心脏：用灌注针从心脏穿刺，插入主动脉。

（4）灌注固定：将注射器连接到灌注针，缓慢注入固定液，直至大鼠肝脏逐渐变为白色。

（5）继续灌注：待肝脏变白后，继续灌注固定液，直至大鼠全身变白。

（6）终止灌注：观察大鼠四肢抽动，表明灌注液进入大脑，待抽动完全停止，全身组织器官固定良好。

3. 取材：将固定好的大鼠组织器官取出，放入4%多聚甲醛固定液中浸泡。

四、实验结果1. 灌注固定后，大鼠组织器官结构清晰，细胞形态良好。

2. 部分大鼠在灌注固定过程中出现心脏破裂，导致灌注失败。

3. 部分大鼠在灌注固定过程中出现血压下降，需及时调整灌注速度。

五、实验讨论1. 灌注固定是研究组织器官形态结构的重要技术手段，操作过程中需严格按照步骤进行，确保固定效果。

2. 动物处死时，应避免过度麻醉，以免影响固定效果。

3. 灌注固定过程中，要注意观察动物的生命体征，及时发现并解决可能出现的问题。

4. 灌注固定液的选择应根据实验需求进行，如需观察细胞形态，可选择4%多聚甲醛固定液。

5. 实验过程中，要注意无菌操作，避免污染。

六、实验结论本次实验成功完成了大鼠灌注固定，取得了良好的固定效果。

通过观察灌注固定后大鼠组织器官的结构变化，为后续实验研究提供了良好的基础。

一种大鼠腰膨大背根神经节取材的改良方法崔媛媛;王兰;赵璇;徐浩;张婷;史娟【摘要】Objective To investigate an improved method of effective extracting dorsal root ganglion (DRG) of lumbar enlargement inrats.Methods We compared the efficiency of two methods to remove DRG.The tradi-tional one is through directly exposing foramen intervertebrale followed by disecting the DRG.The improved one is to expose and pull sciatic nverve thereby removing DRGs.Results By the traditional method,we successfully ob-tained 3.07±1.28 complete DRGs among six ones of lumbar enlargement (L4 ,L5 ,L6 segments,both sides)in each rat.The averaged time spent for each ganglion is 5.6±1.18min.Employing the improved method raised the num-ber of complete DRGs to 4.33±1.11 whereas shortened the time spent for each to1.73±0.88 min.There was sta-tistical significance between the two groups (P<0.05).Conclusion The improved methodis more effective to ex-tract complete DRGs and to get high-quality tissue for further morp and molecular biological experiments.%目的：探讨一种简便、快速、完整取出大鼠腰膨大背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)的改良方法。

一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离
培养方法
嘿，咱今儿就来讲讲这原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法。

这可不是个简单事儿啊，就好像要从一堆宝藏里精准地找出最闪亮的那颗宝石一样！
先说说取材吧。

咱得从那活蹦乱跳的大鼠或小鼠身上下手。

这可得小心点，别把它们弄疼了，还得快准狠地把胃给取出来。

这就像是在跟时间赛跑，稍微慢点，那细胞可就不乐意了。

取出来胃之后，就得清洗啦。

就跟咱洗衣服似的，得把那些脏东西都洗掉，给细胞一个干干净净的“家”。

然后就是关键的一步，把胃粘膜上皮细胞给分离出来。

这可不容易啊，得有耐心，就跟绣花似的，得一点一点来。

接下来就是培养啦。

这就好比给细胞准备了一个舒适的小窝，温度啊、湿度啊都得恰到好处。

给它们提供足够的营养，让它们能茁壮成长。

你说这细胞多娇气啊，稍微有点不合适就不乐意长了。

但咱不能怕麻烦呀，谁让它们这么重要呢！想想看，要是能把这些细胞培养好，那能为科学研究做出多大的贡献啊！
有时候我就想，这细胞就像一个个小生命，咱得好好照顾它们。

看着它们一点点长大，心里那叫一个高兴。

培养的过程中可得时刻留意着，别让它们出啥岔子。

这就跟照顾小孩子一样，得时刻操心着。

要是有个什么问题，得赶紧想办法解决。

哎呀，说起来容易做起来难啊！但咱不能放弃，得坚持下去。

说不定哪天就有重大发现了呢！总之，这原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法可真是个技术活，需要我们细心、耐心、用心地去对待。

只有这样，才能让这些小小的细胞发挥出大大的作用！。

坐骨神经损伤(SNI)大鼠模型具体方法及步骤原型物种人来源夹闭坐骨神经干导致坐骨神经损伤模式动物品系SPF 级SD大鼠，雄性，8 周实验分组随机分组：对照组，模型组，阳性药物组，受试药物组(三个剂量梯度组)，15只每组实验周期4 weeks建模方法建模方法：对雄性大鼠行腹腔注射麻醉。

将大鼠俯卧位固定于鼠固定架上，铺孔巾，暴露鼠左下肢并剪掉鼠毛。

碘酒、酒精消毒三遍，于左侧股后正中行纵行、长约6-8mm切口，暴露皮下肌肉。

用止血钳钝性分离股二头肌、半腱肌、半膜肌后，分离出白色、粗大的坐骨神经，刺激后左足出现抽动。

距坐骨结节6-8mm处（定位）；用大止血钳夹闭坐骨神经干，压满3扣；挤压5秒钟后松开止血钳，间隔10秒后再夹闭5秒钟，再放松10秒，第三次再夹闭5秒（定时）。

神经干挤压伤宽度约3mm。

9-0无创缝线标记后，将坐骨神经送回原位，整理肌肉，缝合创口；假手术组大鼠麻醉后，仅切开皮肤暴露左侧坐骨神经但不做钳夹，在相应部位相同方法标记后缝合。

后期取材：将取出的动物饲养一周，结束后，注射水合氯醛麻醉大鼠，将鼠仰卧位固定于大鼠固定架上。

自颌下至小腹行胸、复联合切口，切断肋骨，剪断膈肌，暴露出跳动的心脏。

用16号针头由左心尖刺入左心室，用软静脉留置导管沿左心室经主动脉瓣插入主动脉，剪开右心耳。

先用0.9%生理盐水250ml快速冲洗组织内血液，其后用4%多聚甲醛固定液快速推注100ml，再缓慢推注100ml，直至使鼠尾巴翘起，身体逐渐僵硬，颜色变白为止。

灌注后，立即将身体一僵硬的鼠于俯卧位固定于手术台上，由胸-骶部沿脊柱正中切开，暴露及分离背部肌肉，沿十二肋肌部切断T12 L1水平脊柱、脊髓。

沿坐骨神经走行切腰4、腰5、骶1段脊髓和包括挤压伤在内的上下各2mm的坐骨神经。

同法切取假手术组的相应部位等长标本。

分三种方法进行处理及固定。

(1) 4%多聚甲醛固定液中固定，制备石蜡切片。

(2) 2.5%戊二醛液固定后，备做电镜。

第1篇一、实验目的本研究旨在建立大鼠心脏超声心动图检测方法学，验证超声心动图评价大鼠心脏结构和功能的可行性及准确性，为心血管疾病的研究和诊断提供一种无创、连续的方法。

二、实验材料1. 实验动物：健康雄性Wistar大鼠60只，体重200-250g。

2. 超声心动图设备：便携式超声心动图仪。

3. 血流动力学检测设备：多导生理记录仪。

4. 实体标本：取自实验大鼠的左心室。

5. 其他材料：手术器械、生理盐水、麻醉药物等。

三、实验方法1. 实验动物处理：将大鼠随机分为对照组、模型组、干预组，每组20只。

对照组给予正常饲养，模型组给予心肌缺血再灌注损伤模型建立，干预组给予药物干预。

2. 超声心动图检测：使用便携式超声心动图仪，对各组大鼠进行心脏超声心动图检测。

检测指标包括左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）、左室心肌质量（LVM）等。

3. 血流动力学检测：使用多导生理记录仪，对各组大鼠进行血流动力学检测。

检测指标包括心率（HR）、平均动脉压（MAP）、左室压力最大上升速率（+dp/dtmax）、左室压力最大下降速率（-dp/dtmax）等。

4. 实体标本检测：将实验大鼠处死，取出左心室，称重并计算左室心肌质量（LVM）。

四、实验结果1. 超声心动图检测：与对照组相比，模型组大鼠LVEDD、LVESD、LVM、+dp/dtmax、-dp/dtmax等指标均显著升高，EF、FS等指标显著降低（P<0.01）。

干预组大鼠LVEDD、LVESD、LVM、+dp/dtmax、-dp/dtmax等指标均显著降低，EF、FS等指标显著升高（P<0.01）。

2. 血流动力学检测：与对照组相比，模型组大鼠HR、MAP等指标显著升高，+dp/dtmax、-dp/dtmax等指标显著降低（P<0.01）。

干预组大鼠HR、MAP等指标显著降低，+dp/dtmax、-dp/dtmax等指标显著升高（P<0.01）。

大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。

1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。

2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。

肾缺血再灌注损伤大鼠模型具体步骤及说明•原型物种人•来源缺血再灌注，双侧肾动脉夹闭法•模式动物品系SD大鼠，SPF级，雄性，体重220g~250g•实验分组随机分组：对照组，模型组，阳性药物组，受试药物组，15只每组•实验周期24h or 72h•建模方法1. 选取250g左右大鼠，术前禁食12h，自由饮水。

2. 15％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉,大鼠背部去毛，消毒备皮。

3. 在背部脊椎旁1cm、肋骨下缘1cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏,小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。

4. 缺血60min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。

5. 分两层缝合开口，待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。

6. 对照组不做缺血处理，其他操作相同。

7. 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。

麻醉大鼠，下腔静脉取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。

同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。

•应用疾病模型1. 血清生化指标检测：取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。

2. 肾系数检测摘取双侧肾脏后，生理盐水冲洗，称重计算肾系数。

肾系数=双侧肾重（mg）/体重（g）3. 肾小管坏死的评分每张切片×200 倍镜下取外髓质部10 个视野，按0 = 正常，1 = 轻微损伤(受损肾小管< 5%) ，2= 轻度损伤(受损肾小管5 %～25 %) ，3 = 中度损伤(受损肾小管25 %～75 %) ，4 = 重度损伤(受损肾小管> 75 %) 作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数4％多聚甲醛溶液固定48h。

常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋。

石蜡切片进行HE染色和PAS染色。