大鼠心肌细胞说明书

大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。

乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。

新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。

因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。

建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。

2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。

常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。

3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。

新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。

消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。

4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。

分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。

成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。

溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。

由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。

5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。

操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。

在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。

本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。

一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。

将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。

（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。

（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。

（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。

（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。

二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。

（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。

2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。

（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。

三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。

实验动物（大鼠、小鼠、兔）原代心肌细胞产品编号：RAT/MIC/RAB-iCell-c001产品规格：>5×105细胞数产品价格：3930/3910/4350包装规格：1ml冻存细胞悬液或T-25培养瓶细胞详述：心肌的工作细胞包括心房肌和心室肌。

心肌细胞为短柱状，一般只有一个细胞核，心肌细胞之间有闰盘结构。

该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接，但心肌细胞之间并无原生质的连续。

心肌细胞的细胞核多位于细胞中部，形状似椭圆或似长方形，其长轴与肌原纤维的方向一致。

肌原纤维绕核而行，核的两端富有肌浆，其中含有丰富的糖原颗粒和线粒体，以适应心肌持续性节律收缩活动的需要。

细胞特性:1)组织来源于实验动物的正常心脏组织。

2)细胞鉴定：肌球蛋白重链(MHC)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：长柱状细胞，不规则细胞，贴壁培养。

产品的运输和保存：视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。

1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。

2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。

推荐培养基：我们推荐使用iCell原代心肌细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-022）作为体外培养原代心肌细胞的培养基。

产品使用：1)本产品仅能用于科研2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核3)本产品未通过用于活体诊断的审核。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。

在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。

本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。

一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。

以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。

2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。

3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。

4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。

通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。

1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。

正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。

2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。

3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。

可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。

通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。

在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。

大鼠胚胎原代心肌细胞解冻和储存桂林赛奥生物技术有限公司大鼠原代心肌细胞（Primary cardiac myocytes）是一种源于SD大鼠胚胎心脏组织心肌层的亚克隆原代细胞，以贴壁形式生长。

这种细胞保有心肌的多种生物学特性，包括肌球蛋白和肌激酶的表达，可增殖培养并可传代多达10次。

细胞置于冻存管放在液氮罐中储存，一般每一个冻存管所含细胞数> 5 x 105。

1、冻存细胞解冻操作步骤：z预先将解冻培养基置于37℃水浴中加热；z将细胞冻存管从液氮罐中取出并迅速（数分钟内）将其置入37℃水浴中；z分别把12 ml解冻培养基加到75 cm2的培养瓶或10 ml 直径100 mm培养皿内；z缓慢地（不得少于1分钟）把细胞接种到培养瓶或培养皿；z将已经接种细胞的培养瓶或培养皿置于二氧化碳培养箱内，不要过度振摇；z当细胞贴壁时（通常需要数小时），更换新鲜生长培养基并继续培养。

在细胞长满之前作次（传）代培养。

2、次代培养步骤z将培养瓶或培养皿中的培养液吸弃；z用2 ml 的0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA溶液简单清洗细胞层；z加3 ml的Trypsin-EDTA溶液，置37℃二氧化碳培养箱中, 在倒置显微镜下观察细胞层脱落；z加入7.0 ml完全生长培养基，用吸液管轻轻抽吸细胞使细胞分散；z按照1:4～6的比例将细胞再次接种于新的培养瓶或培养皿中，置37℃二氧化碳培养箱中培养；z每2～3天更换一次新鲜培养基。

3、解冻培养液：将5ml 生长培养基与17ml去离子水、3ml胎牛血清（FBS）混合。

4、生长培养基：Dulbecco’s改良任格氏培养基（DMEM），含10% FBS以及1000U/L 青霉素、1mg/L链霉素。

5、培养条件：95%空气；5%CO2；温度37.0℃。

6、储存冷冻液: 生长培养基添加DMSO，浓度为 7.5% (v/v) 。

7、储存操作步骤：将温度从 -20℃降到 -80℃ ( -80℃冰箱或液氮气) ，放置数小时，然后转入-190℃液氮(罐)中。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。

分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。

本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。

1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。

提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。

实验前一天，禁食12小时但允许饮水。

2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。

确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。

(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。

然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。

将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。

加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。

使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。

根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。

将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。

将混合液过滤，去除残留的大块异物。

可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。

收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。

去除上清液，保留沉淀。

再次挤压沉淀，使其成为小碎片。

将沉淀与37°C的Buffer B液混合。

(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。

由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。

因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。

1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。

接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。

用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。

将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。

将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。

观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。

同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。

1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。

沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。

2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。

悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。

通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。

通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。

H9C2 大鼠胚胎心肌细胞
Cat Number：KG444 For Research Use Only
一、组成:
二、客户自备试剂:
1、PBS (凯基货号：KGB5001)
2、Complete growth medium (凯基货号：KGM 12800-500)
3、0.25% （W/V） Trypsin-0.53mM EDTA (凯基货号：KGY0012)
三、细胞简介:
四、常见问题及解决方案: 细胞经过运输后，没有贴壁的细胞，细胞都悬浮。

1、培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以我们会及时安排帮老师解决。

2、细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。

次日观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞
活力正常，剩余漂浮的细胞可以离心去掉，留10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。

客户收到细胞后请务必仔细阅读细胞注意事项，确保细胞的培养条件一致，如果由于培养条件不一致导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

由于运输的情况，所以极个别细胞会出现不稳定，客户收到细胞后务必第一时间和我们联系，告知细胞具体情况，以便我们技术人员能及时有效的和老师沟通，不胜感谢！。