第三节蛋白质的理化性质
及其分离纯化
一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离
（二）蛋白质的胶体性质
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
（四）蛋白质的紫外吸收
（五）蛋白质的呈色反应
（一）蛋白质的两性电离
蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及
侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，
因此在不同pH的介质中，蛋白质的带电状态就不同。
PrNH3+
COOHPrNH3+
COO-PrNH2
COO-OH-
H +OH-
H +兼性离子pH=pI阳离子pHpI
蛋白质的等电点（pI）
•概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
•pI是蛋白质的特征性常数。
•利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。•pH >pI 带负电荷
•pH
•体内多数蛋白pI为5.0左右，
pH为7.45 时多数蛋白带负电荷。
•如pI 偏于碱性－碱性蛋白质
鱼精蛋白组蛋白
•如pI 偏于酸性－酸性蛋白质
胃蛋白酶丝蛋白
（二）蛋白质的胶体性质
•颗粒大小：在1～100nm之间。属胶体。因此溶于水，成为亲水胶体。•稳定亲水胶体的因素：水化膜表面电荷不通透性：半透膜
毛细血管壁------------++++++++++++----
--------（三)蛋白质的变性、沉淀和凝固
1.变性（denaturation）
•概念: 在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。
•变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。天然状态，有催化活性
非折叠状态，无活性，二硫键被还原
天然状态，二硫键恢复，而且正确配对 尿素或2-巯基乙醇
去除变性因素
核糖核酸酶
•变性因素：
物理因素：加热、加压、超声波、
紫外线
化学因素：胍、脲、有机溶剂、
强酸强碱、SDS
-巯基乙醇、
重金属离子
生物碱试剂
•蛋白质变性后的理化和生物学性质改变：
蛋白质分离纯化的技术
前言
蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。
一、蛋白质分离的基本原理
蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。
二、蛋白质分离纯化技术的分类
根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：
1. 分子筛层析：
分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。
2. 表面等电聚焦（IEF）：
表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。
3. 亲和层析：
亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。
4. 透析：
透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。这种方法适用性较广，可以扩大分子分离的范围。
trna结合蛋白质的分离,纯化和鉴定
TRNA结合蛋白质的分离、纯化和鉴定是一个复杂的过程，需要涉及许多技术和实验步骤。以下是一般的实验流程：
1. 细胞培养和TRNA结合蛋白质提取：首先，需要选择一种可供TRNA结合蛋白表达的细胞。表达TRNA结合蛋白的细胞可以通过病毒转染、质粒转染或基因编辑等方法获得。然后，需要经过一系列的细胞培养、细胞裂解和蛋白质提取的步骤，获得含有TRNA结合蛋白的蛋白提取物。
2. 蛋白质组学分析：使用蛋白质组学技术如SDS-PAGE、2D-PAGE等，可以对提取物进行蛋白质分析，并定位TRNA结合蛋白的位置。
3. 亲和层析纯化：从蛋白提取物中纯化TRNA结合蛋白，可以使用亲和柱层析技术。通常，这种方法是基于TRNA分子与TRNA结合蛋白具有特异性相互作用的原理，通过对纯化物进行一系列精简的层析、洗脱和再结晶等步骤，纯化出TRNA结合蛋白。
4. 电泳分离和氨基酸测定：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对纯化的TRNA结合蛋白进行分离。分离出的蛋白质可以通过氨基酸测定，获得每个氨基酸残基的位置和序列。
5. 质谱分析：使用质谱技术，可以用于分析TRNA结合蛋白的完整的序列和特定结构。通过使用 MALDI-TOF质谱、毒蕈碱胶板电泳或其他质谱技术，可以得到蛋白质的分子质量、残基序列等信息。
6. 功能分析：最后，通过功能实验，可以确定TRNA结合蛋白通过哪些方式与其靶标mRNA或其他蛋白分子相互作用，并参与哪些细胞生物学或生物化学过程中。
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实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法
实验目的
1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示
Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)
只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。可根据Rf作为定性依据。 Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂
1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液
⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、
⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风
实验步骤
1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
