大鼠胰岛细胞原代培养

大鼠视网膜神经细胞的原代培养摘要目的:在前人建立的方法上优化SD 大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法，为后续研究提供实验基础。

方法:使用胰酶消化法分离新生1 ～ 3d SD 大鼠视网膜神经细胞，以DMEM/F12 为培养基体外培养，免疫组织化学染色的方法进行鉴定。

结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。

免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(NSE) 抗体反应阳性。

结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。

关键词:细胞培养; 视网膜神经元; 胰蛋白酶消化法; 神经元特异性烯醇化酶引言一个世纪前，从青蛙身上剥离的神经管片段仍能在生理液中维持几天的活性，使得越来越多的神经纤维得到的实时观测以来，体外培养技术已经广泛的应用于生物技术领域。

【1】在没有了完整动物的复杂性，体外培养的方法可以大大提高对视网膜的基本属性和环境的适应性的了解。

在体外系统中，这个界定的实验条件可以很容易设定和维持。

这提供了一个稳定的辅助药理学和分子操纵的平衡，同时保持了完整的组织复杂表型特征。

在这里我们根据一些成功方法报告探讨一下大鼠视网膜神经细胞的原代培养技术。

【2-3】材料与方法动物：实验中使用的所有SD大鼠幼崽均是从青岛实验动物中心根据眼科和视觉研究中动物的ARVO声明，同时保留了出生后1-3SD大鼠的相对温度和湿度条件下获得的SD大鼠幼崽材料：DMEM/F12培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体，兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体，羊抗兔IgG 和HRP-链霉亲和素购自中山Goldbridge生物技术有限公司（北京，中国）。

所有其他试剂均为Sigma公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。

方法：预涂层的聚-D-赖氨酸组织培养皿为了使视网膜神经细胞，紧贴组织培养皿，聚-D-赖氨酸添加到被预先放置盖玻片的24孔板的孔中。

大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

步骤一、实验材料准备1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。

2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。

3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。

二、原代培养方法1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。

2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。

3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。

4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。

三、传代方法弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。

大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞是心肌细胞的主要来源之一，在心脏疾病的研究中具有非常重要的作用。

为了开展相关研究，需要对大鼠心肌细胞进行分离鉴定以及培养，以下是一份详细的操作
步骤。

1. 器材准备
（1）无菌试剂：试剂瓶/管、离心管、移液器、细胞培养基等。

（2）消毒器材：无菌吸管、离心机、高压灭菌器、悬浮液制备仪等。

（3）实验器材：显微镜、培养箱、细胞计数板、细胞离心机等。

2. 心肌细胞的分离
（1）准备新鲜的大鼠心脏组织。

（2）将心脏组织放入离心管中，加入PBS洗涤1-2次。

（3）将心脏组织切成小块，加入预先调配好的组织消化液（如DMEM/F12加入胰蛋白酶），37℃放入恒温水浴中消化2-3次。

（4）将消化的样本离心，去除上清液，加入预备的培养基，悬浮细胞。

（5）进行筛选，并将心肌细胞分离，最终得到心肌细胞。

（1）将分离好的心肌细胞放置在显微镜下观察其形态。

（2）进行免疫荧光染色，使用特定的心肌细胞抗体进行染色，观察细胞核及膜表达，判断其是否为心肌细胞。

（1）将鉴定好的心肌细胞放入预备好的细胞培养基中。

（2）放置于37℃恒温培养箱中，维持培养基液位。

（3）每2-3天更换一次新的培养基。

以上就是大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的操作步骤，具体操作时应注意操作规范
和实验安全，保证实验结果的准确性和可靠性。

大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法大鼠肺成纤维细胞原代提取及培养实验具体步骤及方法将大鼠的肺成纤维细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。

2. 试剂PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。

3. 器械眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培养瓶(Costar)。

二、具体操作1. 明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。

2. 解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。

3. 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。

4. 用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm3大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。

5. 用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。

用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。

组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。

孜亚比提片(HZT)对大鼠胰岛细胞功能的影响发表时间：2011-08-29T11:11:44.513Z 来源：《中外健康文摘》2011年第19期供稿作者：张晓春周燕萍[导读] 降糖孜亚比提片能显著促进胰岛细胞生长和胰岛素分泌，并具有一定保护胰岛细胞功能的作用。

张晓春周燕萍（宜宾市第二人民医院药剂科四川宜宾 644000）【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）19-0031-03【摘要】目的通过胶原酶消化法对大鼠胰腺组织经过短时消化，以获得大量纯度高和功能良好的大鼠胰岛单层细胞，以此为材料研究了孜亚比提片对大鼠胰岛细胞生长和胰岛素释放的影响。

方法胰岛细胞分为正常对照组、不同浓度HZT组（20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml）、高糖组、高糖+不同浓度HZT组（20g/ml，40g/ml，80g/ml）、棕榈酸组、棕榈酸+HZT组（80g/ml）、油酸组、油酸+HZT组（80g/ml）。

将正常对照组，高糖组（33.3mmol/L），高糖+HZT组（80g/ml）；棕榈酸组(0.25mmol/L)，棕榈酸+HZT组（80g/ml），油酸组(0.25mmol/L)，油酸+HZT组（80g/ml）分别在37℃,5%CO2分别培养72h和36h，进行葡萄糖负荷试验，放射免疫法检测培养液中胰岛素水平。

结果高糖+HZT组（80g/ml），棕榈酸+HZT组（80g/ml）和油酸+HZT组（80g/ml）胰岛素分泌量分别显著高于高糖组，棕榈酸组和油酸组（P<0.01），但均低于正常对照组(P<0.01)。

结论降糖孜亚比提片能显著促进胰岛细胞生长和胰岛素分泌，并具有一定保护胰岛细胞功能的作用。

【关键词】胰岛胰岛素细胞培养脂肪酸葡萄糖本实验对新疆地方中药孜亚比提片模拟在高浓度葡萄糖和高浓度游离脂肪酸环境下对体外原代培养大鼠胰岛细胞分泌胰岛素作用，研究孜亚比提片对胰岛细胞功能的影响，从而为新型抗糖尿病药物研发进行初步探索。

中华中医药学刊原代大鼠肝细胞的分离和培养蒋永生1，程向东2，刘文洪1，项海1，姚立1（1．浙江中医药大学，浙江杭州310053；2．浙江省肿瘤医院，浙江杭州310022）摘要：目的:探讨原代大鼠肝细胞分离及培养的简易方法，建立稳定简便的大鼠原代肝细胞分离培养方法。

方法:采用改良原位两步循环灌流法及低速离心法分离原代大鼠肝细胞，常规DMEM :高糖培养基培养原代大鼠肝细胞，测定1周内生长情况，倒置显微镜及扫描电镜观察肝细胞形态变化。

结果:倒置显微镜下观察肝细胞在接种后3h 基本完成贴壁，贴壁的细胞呈卵圆形，24h 后胞体变大变平，随后细胞相互靠拢呈岛状或条索状连接，3d 后扫描电镜下细胞呈现良好形态。

结论:用改良原位两步循环灌注法及低速离心法成功分离并培养原代大鼠肝细胞，可操作性强，可在具备基本细胞培养条件的实验室推广。

关键词：大鼠;原代肝细胞;分离;培养中图分类号：R －332文献标志码：A 文章编号：1673－7717(2013)05－1111－02Isolation and Culture of Primary Rats HepatocytesJIANG Yongsheng 1，CHENG Xiangdong 2，LIU Wenhong 1，XIANG Hai 1，YAO Li 1（1．Zhejiang Chinese Medical University ，Hangzhou 310053，Zhejiang ，China ；2．Zhejiang Cancer Hospital ，Hangzhou 310022，Zhejiang ，China ）Abstract ：Objective ：To investigate a simple and feasible method for primary rats hepatocytes isolation and culture ，and to establish a stable and easy methods of isolation and culture of primary rats hepatocytes．Methods ：Hepatocytes were isolated by using a modified two －step in －situ －circulating perfusion method followed by low －speed centrifugation．The hepatocytes were cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium with high level of glucose．The viabilities of cells were evaluated within one week．Cellular morphological changes were observed by using an inverted microscope and scanning electron microscope （SEM ）．Results ：The elementary adherence completion of the hepatic cells had been posted inoculation after 3h under inverted microscope ，the cells of adherence offerred ovate．The hepatocytes enlarged and flattened round ，attached to the surface of collagen －coated dishes 24h after seeding and then connected with surrounding cells ，forming islands or trabs．After 3days ，cells were well under the SEM．Conclusions ：Primary rats hepatocytes can be successfully i-solated and cultured using a modified two －step in －situ －circulating perfusion method ，which is highly feasible．This method is available to perform in labs with basic cell culture conditions．Key words ：rat ；hepatocytes ；isolation ；culture 收稿日期：2012－12－20基金项目：浙江省钱江人才计划资助项目（Q1770802006）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2101290）作者简介：蒋永生（1987－），男，硕士研究生，研究方向：中药治疗心脑血管研究。

实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1、材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。

1.1.2主要仪器与试剂 5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。

1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。

于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。

大鼠肝细胞原代分离培养方法
（1）麻醉及灌流：将大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。

打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。

剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。

（2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。

（3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。

用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。

（4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。

（5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。

后续隔天换液培养。

TNF-α诱导SD大鼠胰岛细胞凋亡的研究王功玲【摘要】目的体外观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对SD大鼠胰岛细胞凋亡的影响.方法体外获得的SD大鼠胰岛细胞,用不同浓度TNF-α(分别为0、10、30、50 ng/ml)处理24小时.应用脱氧核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测胰岛细胞凋亡率;应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测胰岛细胞Bcl-2和Bax mRNA表达水平的变化.结果 10 ng/ml TNF-α组胰岛细胞凋亡数与对照组比较无显著差异(P＞0.05),30 ng/ml和50 ng/ml TNF-α组胰岛细胞凋亡数与对照组比较显著增加(P均＜0.05).10 ng/ml TNF-α能增加Bcl-2 mRNA表达水平,而30 ng/ml和50 ng/ml TNF-α能显著降低Bcl-2 mRNA表达水平.10ng/ml、30 ng/ml及50 ng/ml TNF-α均能使Bax mRNA表达水平增加.结论TNF-α可呈浓度依赖性诱导体外培养的胰岛细胞凋亡,其机制可能与诱导Bax、抑制Bcl-2有关.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2013(034)010【总页数】4页(P744-747)【关键词】肿瘤坏死因子-α;胰岛细胞;凋亡;Bcl-2;Bax【作者】王功玲【作者单位】泰山医学院附属泰山医院内分泌二科,山东泰安271000【正文语种】中文【中图分类】R587糖尿病(DM)是以慢性血糖升高为特点的代谢性疾病，伴有蛋白质及脂肪的代谢紊乱，久之可引起肾脏、眼、神经等组织严重的并发症。

临床类型主要分为1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)，T2DM以外周胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能失调及其数量的减少为特征[1]，而T1DM中，由于自身免疫导致巨噬细胞和T细胞浸润胰岛组织并分泌一些细胞因子，如IL-1β、TNF-α和IFN-γ等，可诱导β细胞凋亡，从而导致β细胞进行性减少[2]。

原代培养心肌细胞1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。