大鼠胰岛细胞原代培养

原代大鼠胰岛的分离纯化及功能鉴定1)李小东,郭 庆,高璟英,张 婉,武冬梅,刘云峰,章 毅摘要:目的 探讨成年大鼠胰岛分离㊁纯化的方法,为成人胰岛的分离纯化奠定基础㊂方法 通过用胶原酶P 消化胰腺及利用H i s t o p a q u e 1077分离液离心分离纯化雄性S D 大鼠胰岛,用双硫棕(D T Z )染色,吖啶橙碘化丙啶(A O /P I )染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度㊁活性和功能;利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度㊂结果 分离获得的胰岛可被D T Z 和A O /P I 分别染成猩红色和绿色;体外刺激胰岛素分泌实验,2.8mM ㊁8.3mM ㊁16.7mM 葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是:(11.7ʃ1.4)u I U /m L ㊁(38.2ʃ8.7)u I U /m L ㊁(86.3ʃ5.1)u I U /m L ;在2.8mM 葡萄糖基础上,8.3mM 葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度,16.7mM 葡萄糖在8.3mM 葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度㊂结论 采用胶原酶P 消化法及H i s t o p a q u e 1077分离液离心分得的胰岛纯度高,活性㊁功能良好,随着葡萄糖浓度的增加,胰岛细胞中钙离子浓度明显增加㊂ 关键词:胰岛;分离;钙离子;原代大鼠 中图分类号:R 329.2R 256.2 文献标识码:A d o i :10.3969/j.i s s n .16721349.2014.03.051 文章编号:16721349(2014)03034502 老年人是糖尿病高发人群,在全部心脑血管病死亡的病例中,除直接与糖尿病有关外,其余13%的病例与高血糖有关,高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]㊂近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注,其中有很多胰岛移植的研究㊂随着分子生物学技术的发展,虽然各个方面取得了很大进步,但其移植效果并不理想,在人体的胰岛移植中,活性能保持一年以上不超过40%[2]㊂其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高,移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用[3]㊂因此获得足量㊁活性良好的胰岛非常重要㊂本实验采用胶原酶P 消化胰腺及H i s t o p a q u e 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛,并对其活性及功能进行评价㊂1 材料与方法1.1 动物 雄性S D 大鼠,体重250g ~300g,由山西医科大学实验动物中心提供㊂1.2 试剂 胶原酶P 购自瑞士罗氏公司;双硫棕(D T Z )㊁H E P E S ㊁葡萄糖㊁多聚赖氨酸(分子量15~30万)购自美国S i g -m a 公司;1640培养基㊁胎牛血清购自美国H y c l o n e 公司;D i s -pa s e Ⅱ购自美国A m r e s c o 公司;青链霉素(双抗)购自北京索莱宝公司;A O P I 购自南京建成生物科技有限公司;大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所㊂1.3 主要仪器 超净工作台(北京世安科技林净化技术有限公司);C O 2细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技有限公司);台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);奥林巴斯激光共聚焦显微镜I X 81(日本奥林巴斯I X 51)㊂1.4 方法1.4.1 原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养 无菌条件下,大鼠断头处死,迅速打开胸腹,在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住,经胆总管缓慢注入13m L4ħ的1m g/m L 胶原酶P 溶液,38ħ水浴消化11m i n ,取出立即加入20m L4ħ培养液(含10%胎牛血清)终止消化,剧烈振摇胰腺至细沙状,用孔径350μm 的滤网过滤,1200r /m i n ,离心2m i n ,去上清,加入10m L 分离液H i s t o p a q u e1077至管中重悬组织,将10m L1640培养基慢慢顺管壁注入管中,3200r /m i n ,离心23m i n㊂收集界面间的悬浮胰岛,在含10%胎牛血清,100U /m L 青霉素,100μg /m L 链霉素的1640培养基中培养,并置于37ħ,5%C O 2,100%湿度的孵箱中培养[4]㊂将胰岛用含3mm o l /LE D T A 的无钙镁P B S 溶液脱钙后,加入D i s p a s e Ⅱ(5m g /m L )酶液,培养箱孵育6m i n ,用4ħ培养液终止消化,吹打使胰岛分散,1000r /m i n ,离心2m i n,将胰岛细胞接种在培养皿中,按胰岛培养条件培养[4]㊂1.4.2 大鼠胰岛的D T Z 纯度鉴定 D T Z10m g 溶于10m L D M S O ,用H a n k s 液(p H 7.8)1ʒ1000稀释,0.22μm 孔径滤膜过滤,与胰岛制备物混合,室温10m i n 后镜检[5];大鼠胰岛的A O /P I 活性鉴定:用H a n k s 液配制储存液,A O :670μm o l /L ,P I :750μm o l /L ,4ħ避光保存,使用前取0.01m L A O 与1m L P I 混合,用H a n k s 液10倍稀释,0.22μm 孔径滤膜过滤,与胰岛混合10m i n ,在荧光显微镜下采用490n m 激发光,510n m 发射光镜检[6]㊂1.4.3 胰岛素分泌实验 配置葡萄糖浓度分别是2.8mM ,8.3mM ,16.7mM 的K R B H 孵育液㊂方法:①取6个E p p e n d o r f 管标号,各加1m L2.8mM 葡萄糖的K R B H 液,每管挑入5个胰岛,37ħ孵育30m i n 后,弃上清㊂②每管再加入1m L2.8mM 葡萄糖的K R B H 液孵育,37ħ孵育30m i n ,收集上清,标号,-20ħ保存待测㊂③依次给予8.3mM 葡萄糖㊁16.7mM 葡萄糖孵育,方法同上,收集上清,-20ħ保存待测㊂用放射免疫法检测上述待测样品㊂1.4.4 激光共聚焦检测细胞内部钙离子浓度 胰岛用F l u o 4AM (4μM )染料在37ħ的条件下孵育半小时,孵育完用含2.8mM 糖的H a n k s 液轻轻冲洗两遍,防止染液残留影响之后的细胞内钙离子浓度的测定,再加入2m L 含2.8mM 糖H a n k s 液㊂使用奥林巴斯激光共聚焦显微镜I X 81观察,设置激光波长494n m ,发射波长516n m ㊂所得到的比值F /F 0(细胞荧光减去背景荧光和自身荧光)反应细胞内钙离子浓度的变化[4]㊂1.5 统计学处理 计量资料以均数ʃ标准差(x ʃs)表示,统计分析用S i g m a p l o t 12.0统计软件,采用两组t 检验或配对t 检验进行分析,P <0.05有统计学意义;激光共聚焦的数据用F V 101)为国家自然科学基金(N o .N S F C81070662,81273564),山西省自然科学基金(N o .20120110398),山西省高等学校优秀青年学术带头人支持计划(N o .201124),山西省留学人员科技活动项目择优资助(N o .2011762),山西省回国留学人员科研资助项目(N o .2012046),山西省卫生厅科研课题(N o .201201062)㊂㊃543㊃中西医结合心脑血管病杂志2014年3月第12卷第3期A S W3.0软件(日本奥林巴斯公司)进行分析㊂2结果2.1原代大鼠胰岛一般只离体培养7d,在体视显微镜下观察,胰岛质地饱满,呈椭圆形或圆形,透光率较小,直径在100~ 300μm;胰岛细胞在倒置显微镜下观察呈球形,部分细胞之间相连成细胞团㊂胰岛中包含α,β,δ和p p细胞,但是在体积上有明显差别,β细胞是α细胞的2~3倍,δ细胞比α细胞更小,β细胞直径11~13.5μm㊂2.2 D T Z和A O/P I对胰岛纯度及活性鉴定分别在40倍, 100倍的显微镜下观察,可见全部胰岛被D T Z染成猩红色;在490n m激发光,510n m发射光的荧光显微镜下观察,培养过夜的胰岛97%以上可被A O/P I染成绿色㊂2.3 胰岛素分泌实验胰岛分别在葡萄糖浓度为2.8mM (2.8G),8.3mM(8.3G),16.7mM(16.7G)的K R B H溶液中孵育半小时后,所测胰岛素值分别为:(11.7ʃ1.4)u I U/m L, (38.2ʃ8.7)u I U/m L,(86.3ʃ5.1)u I U/m L,胰岛素分泌量随葡萄糖浓度增加而增加㊂2.4激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度实验中,在2.8mM葡萄糖(n=10)的基础上,8.3mM葡萄糖(n=10)可以明显升高胰岛细胞内的钙离子浓度;16.7mM葡萄糖(n=10)在8.3mM的葡萄糖的基础上进一步的升高了胰岛细胞中的钙离子浓度㊂2.8G v s8.3G(P<0.05);2.8G v s16.7G(P< 0.001);8.3Gv s16.7G(P<0.01)㊂3讨论胰岛细胞移植为治疗胰岛素依赖性糖尿病开辟了一条新的途径[7]㊂胰岛移植不仅可纠正糖代谢紊乱,还能避免因血管病变引起的眼㊁肾㊁脑和心血管并发症,但胰岛的分离纯化是一个较复杂的过程,所获胰岛的产量和质量受很多因素影响,稍有偏差即会直接影响治疗效果,因此备受关注[8]㊂如何获得高纯度及高活性的胰岛仍是亟待解决的问题㊂目前成年大鼠胰岛分离纯化多采用机械研磨与F i c o l l密度梯度离心法[9],而本实验采用单一的H i s t o p a q u e1077是即用型的,减少了F i c o l l不同密度分离剂的配制及除菌的步骤㊂由于纯化时只有H i s t o p a q u e1077和1640培养基两个密度,纯化梯度易于形成,使得胰岛的纯化变得简便,缩短了分离大鼠胰岛的时间㊂此法减少了多步分离过程中不确定的因素对胰岛质量的影响,尽可能快的给予离体胰岛营养,利于获得纯度高,活性良好的胰岛㊂H i s t o p a q u e1077较F i c o l l等能提供一个更好的渗透环境,能更好地保持胰岛的活性与功能㊂实验证实,胶原酶P消化胰腺及利用H i s t o p a q u e1077分离得到的大鼠胰岛纯度高㊁活性㊁功能良好㊂同时我们总结了大鼠胰岛分离纯化过程中一些体会:①胰腺灌注的成功与否是分离纯化胰岛的关键,文献报道多采用4.5号头皮针穿刺灌注,为防止针尖过于锐利,刺破胆管壁致胶原酶外溢,我们采用与此针头同样粗细的细塑料管(尖端较钝)进行灌注㊂②灌注时用线结扎位置要在最低一支胆管与主干的汇合支以下,以防止部分酶液倒流至肝内㊂③应采用4ħ的胶原酶灌注,因温度高时胶原酶过早消化胰管和腺泡,灌注好的胰腺应置于0ħ的冰袋上剔除非胰腺组织,这些非胰腺组织无法消化且会黏附正常胰腺组织,不利于过滤㊂④胰腺消化分散后,应立即加入20m L4ħ培养液,混匀终止消化㊂如果培养液用量太少,则不能终止胶原酶的作用,造成过度消化,破坏胰岛完整性,影响分离效果[10]㊂D T Z是一种螯合锌㊁铜㊁铅等的指示剂,因为大鼠的胰岛β细胞含锌,D T Z染液可将胰岛染成猩红色,所以D T Z对胰岛是特异性染色[5];A O为浸润性染料(膜通透性),可侵入活细胞与双链D N A结合发出绿色荧光;P I为排斥性染料(膜不通透性),不能进入活细胞,与死亡(膜通透性改变)细胞的核酸结合,发出红色荧光[6]㊂实验中,所有胰岛可被染成猩红色,表明用此种实验方法分得的胰岛纯度较高;A O/P I可将97%以上胰岛染成绿色,表明胰岛活性良好㊂葡萄糖依赖性的胰岛素分泌实验证实了胰岛功能良好㊂胰岛细胞中钙离子浓度会升高会促进胰岛素分泌㊂我们对胰岛细胞中钙离子浓度进行检测后发现,利用高浓度葡萄糖刺激胰岛时,可明显升高胰岛中钙离子浓度㊂利用胶原酶P消化胰腺及利用H i s t o p a q u e1077分离液离心纯化胰岛是一种较简单可靠的方法㊂参考文献:[1] Z h a oY Q,L i a nY Y,L i G F,e t a l.I n f l u e n t i a l f a c t o r s f o r s h o r t t e r mp r o g n o s i s o f p a t i e n t sw i t ha c u t ec e r e b r a l i n f a r c t i o n:Al o g i s t i cr e-g r e s s i o na n a l y s i s[J].M e d i c a l,2011,36(3):265268.[2] B r e t z e lR G,H e r i n g B J,S c h u l t zA O,e t a l.I n t e r n a t i o n a l i s l e t t r a n s-p l a n t r e g i s t r y r e p o r t[M].19961997.S p r i n g e r,1996,15360.[3]杨永生,孙宝震,解英俊,等.大鼠胰岛分离纯化方法的改进[J].中国实验诊断学,2006,10(12):14861488.[4] Z h a n g Y,L i uY,Q uJ,e t a l.F u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o no fh y p e r-p o l a r i z a t i o n a c t i v a t e dc y c l i cn u c l e o t i d e g a t e dc h a n n e l si nr a t p a n c r e a t i cβc e l l s[J].,2009,203(1):4553.[5] L a t i f Z,N o e l J,A l e j a n d r oR.As i m p l em e t h o d o f s t a i n i n g f r e s h a n dc u l t u r ed i s le t s[J].T r a n s p l a n t a t i o n,1988,45(4):827.[6] L e eD Y,Y a n g K,L e eS,e t a l.O p t i m i z a t i o no fm o n o m e t h o x y‐p o l y e t h y l e n e g l y c o l g r a f t i n g o nt h e p a n c r e a t i c i s l e tc a p s u l e s[J].2002,62(3):372377.[7]张鑫,高居忠,王学明,等.成年大鼠胰岛分离纯化的实验研究[J].首都医科大学学报,2003,24(3):314316.[8]O n e i lJ J,S t e g e m a n nJ P,N i c h o l s o n D T,e ta l.T h ei s o l a t i o na n df u n c t i o no f p o r c i n e i s l e t s f r o m m a r k e tw e igh t pi g s[J].C e l l T r a n s-p l a n t a t i o n,2001,10(3):235246.[9] B r a n d h o r s tD,B r a n d h o r s tH,H e r i n g B J,e t a l.I s l e t i s o l a t i o n f r o mt h e p a n c r e a s o f l a r g em a mm a l s a n dh u m a n s:10y e a r s o f e x p e r i e n c e [J].E x p e r i m e n t a l C l i n i c a l E n d o c r i n o l o g y&D i a b e t e s,2009,103(S02):314.[10]李永翔,李戈,董维平,等.大鼠胰岛分离纯化技术的改进[J].复旦学报:医学版,2006,33(2):2668.作者简介:李小东,现为山西医科大学2010级研究生(邮编:030001);郭庆㊁高璟英㊁张婉㊁武冬梅㊁章毅(通讯作者),工作于山西医科大学基础医学院药理教研室(邮编:030001);刘云峰,工作于山西医科大学第一医院㊂(收稿日期:20130518)(本文编辑王雅洁)㊃643㊃C H I N E S EJ O U R N A L O FI N T E G R A T I V E M E D I C I N E O N C A R D I O/C E R E B R O V A S C U L A R D I S E A S E M a r c h2014 V o l.12 N o.3。

原代大鼠胰岛的分离纯化及功能鉴定老年人是糖尿病高发人群，在全部心脑血管病死亡的病例中，除直接与糖尿病有关外，其余13%的病例与高血糖有关，高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]。

近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注，其中有很多胰岛移植的研究。

随着分子生物学技术的发展，虽然各个方面取得了很大进步，但其移植效果并不理想，在人体的胰岛移植中，活性能保持一年以上不超过40%[2]。

其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高，移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用[3]。

因此获得足量、活性良好的胰岛非常重要。

本实验采用胶原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛，并对其活性及功能进行评价。

1材料与方法1.1动物雄性SD大鼠，体重250 g～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2试剂胶原酶P购自瑞士罗氏公司；双硫棕（DTZ）、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸（分子量15～30万）购自美国Sigma公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；DispaseⅡ购自美国Amresco公司；青链霉素（双抗）购自北京索莱宝公司；AOPI 购自南京建成生物科技XX公司；大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.3主要仪器超净工作台（北京世安科技林净化技术XX公司）；CO2细胞培养箱（北京博奥恒信生物科技XX公司）；台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器XX公司）；奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81（日本奥林巴斯IX51）。

1.4方法1.4.1原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下，大鼠断头处死，迅速打开胸腹，在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住，经胆总管缓慢注入13 mL 4 ℃的1 mg/mL胶原酶P溶液，38 ℃水浴消化11 min，取出立即加入20 mL 4℃培养液（含10%胎牛血清）终止消化，剧烈振摇胰腺至细沙状，用孔径350 μm的滤网过滤，1 200 r/min，离心2 min，去上清，加入10 mL分离液Histopaque 1077至管中重悬组织，将10 mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中，3 200 r/min，离心23 min。

原代细胞培养操作步骤原理：将动物机体的所有组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置适宜的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程之为称原代细胞培养。

操作步骤（一）胰酶消化法1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，放入75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和**浸入体内）然后用碘酒**腹部，取胎鼠带入超净台内（或者将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。

2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。

细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。

（二）组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

大鼠胰岛β细胞分离与培养的初步研究的开题报告
题目：大鼠胰岛β细胞分离与培养的初步研究
一、研究背景
胰岛β细胞是胰岛内分泌细胞中最重要的细胞，其主要功能为分泌胰岛素调节血糖。

因此，研究胰岛β细胞的分离和培养对于理解胰岛功能异常的疾病如糖尿病的发生、病理机制的探究以及药物筛选等方面具有重
要意义。

二、研究问题和方法
1. 研究问题
（1）如何从大鼠胰腺中分离出高纯度的β细胞？
（2）培养条件对β细胞的生长和分泌功能的影响是什么？
（3）是否可以通过其分泌的胰岛素的水平来评估β细胞的功能状态？
2. 研究方法
（1）采用胰酶消化、密度梯度离心等方法分离大鼠胰腺中的β细胞。

（2）设计多组不同的培养条件，通过比较细胞形态、分泌功能等指标来寻找最佳培养条件。

（3）采用ELISA法测定胰岛素水平来评估β细胞的功能状态。

三、研究意义和预期结果
本研究旨在建立大鼠胰岛β细胞的分离和培养方法，并探究培养条件对于β细胞的生长和分泌功能的影响。

通过该研究，可为后续糖尿病的研究提供重要的实验基础和资料。

预期结果为成功建立高效、可行的胰岛β细胞分离和培养方法，并获得最佳培养条件，得到稳定、高纯度、高活
性的β细胞，以及有对β细胞功能状态评估的特异性标准。

动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。

用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。

1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。

三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。

四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。

2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。

（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。

五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。

2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。

3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。

制的细胞悬液。

六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。

（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。

RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。

其中含有10%胎牛血清。

）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。

大鼠胰岛细胞的分离培养与鉴定苏力担卡扎·仇曼;林海;何铁英;程坤;王松;郝晓文;陈启龙;韩玮【摘要】目的探讨胰岛细胞的分离、培养与鉴定.方法从实验室中挑选出30只成年雄性大鼠,将胶原酶注入大鼠的胰腺导管,聚蔗糖梯度离心法分离胰岛细胞,并培养与鉴定胰岛细胞.培养1周后用双硫腙(DTZ)行胰岛细胞鉴定.用丫啶橙(Ao)、碘丙啶(PI)检测胰岛细胞活性.结果经过分离与纯化,大鼠胰岛细胞的获得率较高且较稳定;分离后的胰岛细胞在适宜环境中生长,生长状态较佳,在培养后的12 ～ 24 h可贴壁,在培养后4～5d细胞生长状态达到顶峰,细胞完好,且折光性能优异.利用免疫组化法鉴定胰岛细胞,分离的细胞SMA及PDGFR表达呈阳性,少数细胞vWF表达呈阳性.结论我科此次分离纯化大鼠胰岛细胞的方法为逆行灌注胶原酶+原位消化+Fico11液梯度分离法,实验结果显著,能在一定程度上获取纯度较高的大鼠胰岛细胞.分离后的胰岛细胞在培养4～5d后达到最佳状态,适用于作为实验室胰岛细胞功能深入研究的实验材料.【期刊名称】《肝胆胰外科杂志》【年(卷),期】2016(028)005【总页数】4页(P389-392)【关键词】胰岛细胞;分离;培养;鉴定;大鼠【作者】苏力担卡扎·仇曼;林海;何铁英;程坤;王松;郝晓文;陈启龙;韩玮【作者单位】新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科,新疆乌鲁木齐830054【正文语种】中文【中图分类】Q81320世纪90年代末期以来，国内及国外许多优秀的医学研究学者把实验室大鼠胰岛细胞的分离与培养作为研究胰岛细胞功能的一项重要科学课题［1-2］。

新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。

2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。

0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。

3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。

二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。

2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。

然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。

重复以上过程。

取材完毕后，撤掉取材的手术器械。

注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。

3. 用第二套手术器械进行下列操作。

用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。

大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养是指从活体组织中分离出的未经连续传代的细胞进行培养和繁殖。

以下是大鼠原代细胞培养的一般步骤：
1. 材料准备：准备培养皿、培养基、PBS（磷酸盐缓冲液）、消化酶、抗生素等。

2. 组织采集：使用无菌操作将大鼠体内所需组织（如肝脏、脾脏、肺组织等）取出。

3. 组织处理：将采集到的组织置于PBS中，用显微刀或剪刀切碎组织，使其细胞释放出来。

4. 细胞分散：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）对组织进行消化，使细胞分散开来。

5. 筛选和洗涤：倒入含有培养基的离心管中，并通过滤网筛除组织碎片、未被消化的残余物等。

6. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，以确定合适的细胞密度。

7. 细胞培养：将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒的培养皿中，并加入适量的培养基。

8. 培养条件：将培养皿放置在恒温培养箱中，设置适当的温度、湿度和CO2浓度，提供细胞生长所需的营养物质。

9. 观察和维护：定期观察细胞的形态、增殖情况和细胞污染情况，并进行必要的维护工作，如培养基更换、细胞传代等。

10. 实验应用：根据具体实验目的，将培养好的大鼠原代细胞用
于各种细胞学、分子生物学和药理学实验中。

需要注意的是，大鼠原代细胞具有有限的传代次数，因此在实验中需要及时进行细胞传代，以保证细胞的正常生长和功能。

同时，严格遵守无菌操作规范，确保细胞培养的纯度和质量。

大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良
吴志香;王玉霞;刘国良
【期刊名称】《陕西医学杂志》
【年(卷),期】2007(036)004
【摘要】目的:探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件.方法:运用胶原酶Ⅴ原位灌注法分离胰腺,Ficoll 400纯化胰岛细胞,双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛,运用倒置显微镜观察细胞生活状态,放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能.结果:每只大鼠可分离438±27个胰岛/胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GSIS实验中胰岛素释放指数SI为
3.25±0.26.结论:本分离纯化方法可获得数量多,质量高的胰岛细胞,为原代胰岛细胞的体外研究提供实验条件.
【总页数】4页(P392-394,397)
【作者】吴志香;王玉霞;刘国良
【作者单位】辽宁中医药大学附属第一医院;中国医科大学附属第四医院;中国医科大学附属第一医院内分泌科,沈阳110001
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.大鼠胰岛细胞原代培养方法比较研究 [J], 张莉;吕宗科
2.一种改良的大鼠胰岛细胞原代培养方法 [J], 邓秀玲;陈璐璐;袁莉;周慜
3.新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良 [J], 钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新
4.大鼠胰岛β细胞分离与原代培养方法探讨 [J], 刘玉溥;吕庆国;童南伟
5.一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法 [J], 程俊;曾晓荣;谭晓秋;李鹏云;文静;陈琳琳;杨艳
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大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37℃恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化。

混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。

将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。

24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。

我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。

我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。

胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原Ⅴ酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。

方法是我根据文献稍作改动后实施的。

胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。

溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。

没有红染的细胞就是没有胰岛啊。

还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧大鼠胰岛细胞原代培养一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks 液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS （pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。

ｔｍｊｉ】大学临床医学硕士专业学位论文
（ｐ＜ｏ．０１）。

５．胰岛单细胞的流式细胞检测及分选：
根据ＶａｎＤｅＷｉｎｋｅｌ［９】和ＳｔａｎｇｄＩｓ］的理论，当１３细胞处于２．８ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖条件下时，在ＦＡＣＳ中以１００ｒｏＷ，４８８ｎｍ激光照射，分离５１０～５５０ｈｍ波长处的细胞即为胰岛Ｂ细胞。

如图５～７
图５胰岛细胞混悬液的检测结果（Ｉ）
图６胰岛细胞混悬液的检测结果（２）图７胰岛Ｂ细胞的分选
胰岛细胞混合液经检测后，平均每只大鼠共有细胞总数为１９２９５个，其中在５１０～５５０ｎｍ波长处细胞（Ｂ细胞）为６０７１个，占细胞总数的３１．５％。

分离后的细胞经细胞计数板人工计数后，所得细胞为５６８８
四川大学临床医学硕士专业学位论文
图１分离后的胰岛（ｘ１００）
图２ＤＴＺ染色后的胰岛（Ｘ１００）
图３胰岛培养第二天（Ｘ２００）
１９
四川大学临床医学硕士专业学位论文
图４胰岛单细胞悬液（左图含有一未被完全消化的胰岛）ｘ１００
图８胰岛Ｄ细胞免疫组织化学染色Ｘ２００
×ｌ∞
图９刖分离后的胰岛Ｐ细胞２０
×２∞
四川大学临床医学硕士专业学位论文
图ｌＯ培养２·Ｊ－时后的Ｄ细胞ｘ４００图１１培养４小时后的Ｄ细胞ｘ４００
图１２培养１６小时后的Ｄ细胞一４００
（葡萄糖１６．Ｏｍｏｌ／Ｌ）（葡萄糖６．１ｍｏｌ／Ｌ）
图１３培养２４小时后的Ｄ细胞ｘ２００
２１。

大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37℃恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化。

混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。

将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。

24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。

我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。

我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。

胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原Ⅴ酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。

方法是我根据文献稍作改动后实施的。

胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。

溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。

没有红染的细胞就是没有胰岛啊。

还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧大鼠胰岛细胞原代培养一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。

原代大鼠胰岛细胞分离纯化及单细胞培养初探罗瑞琼;韦芳;荣曦;刘红【摘要】目的:探讨获得高质量、数量多的原代大鼠胰岛细胞的有效可靠的方法.方法:以V型胶原酶顺行灌注大鼠胆总管消化胰腺,以Histopaque 1077等密度区带离心法分离胰岛和胰腺腺泡组织.以双硫腙染色及免疫组化法分别鉴定提取物,胰岛素释放试验鉴定胰岛的活性.结果:经Histopaque 1077等密度区带离心法分离纯化,每只大鼠平均获取(251±26)枚胰岛.双硫腙染色后完整胰岛呈猩红色细胞团.胰岛单细胞培养及胰岛素释放试验起始2.8 mmol/L低糖培养胰岛素分泌量为(23.53±5.946) pmol/L,16.7 mmol/L高糖刺激后胰岛素分泌量为(32.61±4.085) pmol/L,最后恢复2.8 mmol/L低糖培养胰岛素分泌量为(27.81±3.616)pmol/L,3者之间比较差异均有统计学意义(P＜0.05),提示胰岛细胞活性良好.结论:用Histopaque 1077等密度区带离心法分离纯化原代大鼠胰岛细胞兼具有数量多、活性好、纯度高的优点,可继续用于研究.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2016(033)002【总页数】4页(P208-211)【关键词】分离纯化;胰岛细胞;等密度区带离心【作者】罗瑞琼;韦芳;荣曦;刘红【作者单位】广西医科大学第一附属医院老年内分泌科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R-332目前体外研究胰岛细胞的细胞模型主要有胰岛细胞肿瘤克隆产生的胰岛细胞瘤细胞系以及动物活体取材获得的原代胰岛细胞。

相对于肿瘤细胞而言，原代细胞最接近机体本身的生物学属性，对外界环境的变化也较敏感，更适合生理机制等方面研究。

大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定崔立华;张淑坤;崔乃强;夏亚飞;许大辉【摘要】目的：分离培养大鼠胰腺星状细胞,为体外研究胰腺纤维化提供细胞模型。

方法：采用酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离胰腺星状细胞,通过倒置显微镜观察细胞形态，油红O染色和免疫细胞化学染色desmin，α-SMA进行细胞鉴定，并绘制传代后细胞生长曲线。

结果：原代培养的大鼠胰腺星状细胞呈星形或梭形生长；原代胰腺星状细胞油红O染色胞浆均可见红色密集脂滴，直至传代后消失；原代胰腺星状细胞培养48 h后，desmin表达开始减弱，α-SMA表达开始增强；传代后desmin基本不表达，α-SMA阳性表达100%；传代后第3 d~5 d 的胰腺星状细胞处于快速增殖阶段。

结论：酶消化结合Nycodenz密度梯度离心法分离培养大鼠胰腺星状细胞纯度高，重复性好，可以满足体外研究的需要。

%Objective To establish a method for isolation and culture of rat pancreatic stellate cell (PSC). Methods PSCs were isolated by enzyme digestive method combined Nycodenz discontinuous density gradi-ent centrifugation. The cell morphology was observed by inversion microscope. Oil red O staining and immunos-taining of desmin and α-SMA were performed to identify PSC. The growth curve was drawn to understand the characteristics of PSC. Results The primary PSCs were star or spindle shape during culture . There were nu-merous lipid drops in cytoplasm of primary PSC and the lipid drops disappeared after passage. After 48 hours, the primary PSCs were devoid of desmin and positive for α-SMA. There was no expression of desmin and 100%expression of α-SMA after passage. The fast proliferation period of passage PSC was from the third day to the fifthday. Conclusion PSCs were successfully isolated by enzyme digestive method combined Nycodenz dis-continuous density gradient centrifugation and this method could meet the demand for research of PSC in vitro.【期刊名称】《中国中西医结合外科杂志》【年(卷),期】2014(000)005【总页数】4页(P504-507)【关键词】胰腺星状细胞;细胞培养;胰腺纤维化【作者】崔立华;张淑坤;崔乃强;夏亚飞;许大辉【作者单位】天津市中西医结合急腹症研究所天津 300100;天津市中西医结合急腹症研究所天津 300100;天津市南开医院肝胆胰外科天津 300100;天津市南开医院药学科天津 300100;天津市南开医院肝胆胰外科天津 300100【正文语种】中文【中图分类】Q95-33;Q952.5纤维化是慢性胰腺炎的典型病理特征，活化的胰腺星状细胞（pancreatic stellate cell，PSC）是胰腺纤维化的主要效应细胞。

大鼠胰岛周细胞的分离培养与鉴定刘明明;李炳蔚;王冰;孟凡星;赵永刚;盛有明;李宏伟;修瑞娟【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)011【总页数】2页(P1562-1563)【作者】刘明明;李炳蔚;王冰;孟凡星;赵永刚;盛有明;李宏伟;修瑞娟【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005;中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所卫生部微循环重点实验室,北京100005【正文语种】中文【中图分类】R587.1胰岛周细胞分布于胰岛毛细血管和微血管管壁，是胰岛微循环的重要组成细胞之一，具有维持胰岛β细胞正常生理功能的作用。

胰岛周细胞数量及功能异常可能是糖尿病及其并发症的病理生理基础[1]。

周细胞具有组织来源特异性，应用胰岛周细胞研究其在糖尿病发病机制中的作用更为合理。

本研究旨在建立大鼠原代胰岛周细胞的分离培养及鉴定方法，为研究周细胞及胰岛微循环在糖尿病发病机制中的作用提供细胞学基础。

1.1 实验动物:SPF级8周龄雄性Wistar大鼠，质量200～250 g [北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2012- 0001]。

本研究经中国医学科学院微循环研究所动物伦理委员会批准。

1.2 主要实验试剂:胶原蛋白酶V、Histopaque- 1077、双硫腙(dithizone,DTZ)(Sigma公司)；内皮细胞生长因子(Sciencell公司)；兔抗大鼠vWF抗体(Santa Cruz公司)；兔抗大鼠α-SMA抗体、兔抗大鼠PDGFR-β(Abcam公司)和Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG(Life Technologies公司)。