人肺腺癌细胞HCC4006对厄洛替尼耐药细胞株的建立及其耐药机制鉴定
梁继珍，李理，易基群△
广州市红十字会医院肿瘤科（广东广州510220）
【摘要】目的建立人肺腺癌EGFＲ敏感突变细胞HCC4006对厄洛替尼耐药细胞株，并初步鉴定其耐药机制。方法厄洛替尼采用梯度递增的方式处理HCC4006细胞，直至HCC4006在厄洛替尼8μmol/L浓度下，生长速度接近HCC4006细胞，视为HCC4006厄洛替尼耐药细胞株即HCC4006EＲ；使用MTT法分别检测厄洛替尼、阿伐替尼对HCC4006、HCC4006EＲ细胞的增殖抑制作用；计算HCC4006、HCC4006EＲ对厄洛替尼、阿伐替尼的IC
50
值及耐药指数；显微镜下观察HCC4006EＲ细胞形态变化，并使用免疫印迹法检测常见上皮间质转化标志在HCC4006及HCC4006EＲ中的蛋白表达水平。结果HCC4006EＲ细胞对厄洛替尼耐药，其
IC
50
值为（11393.33ʃ18.95）μmol/L，是HCC4006的260.84倍；HCC4006EＲ细胞对第2代EGFＲ－TKI阿伐替尼具有交叉耐药（耐药指数为258.78）；HCC4006EＲ较HCC4006细胞呈现上皮间质转化形态改变，其间质标志ZEB1、N－cadherin、vimentin升高而上皮标志E－cadherin、ESＲP1/2蛋白下降。结论成功建立对厄洛替尼耐药的HCC4006EＲ细胞株，且其对阿伐替尼具有交叉耐药；HCC4006EＲ针对EGFＲ－TKI的耐药可能与上皮间质转化有关。
【关键词】非小细胞肺癌；肿瘤抗药性；表皮生长因子受体－酪氨酸激酶抑制剂
肺癌是目前全球死亡人数最高的恶性肿瘤，其中85%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC），大约2/3的NSCLC患者存在致癌驱动基因，其中一半的患者具有治疗价值的靶点，而最为常见的驱动基因事件为表皮生长因子受体（EGFＲ）突变［1－2］。目前靶向EGFＲ的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物已发展为3代药物：包括第1代药物吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼等，第2药物阿伐替尼，第3代药物奥希替尼等。EGFＲ－TKI的临床应用将EGFＲ突变型晚期NSCLC中位生存时间由8 10个月延长为3年以上［3］。但是部分靶向治疗患者在治疗的过程中不可避免地出现耐药。建立EGFＲ－TKI耐药细胞株并进一步研究其耐药机制具有重要的现实意义。本研究于2017年2—8月选择存在EGFＲ19外显子缺失突变的人肺腺癌细胞株HCC4006，使用第1代EGFＲ－TKI厄洛替尼处理，建立对厄洛替尼耐药的细胞株并初步评估其耐药机制，为后续相关研究提供基础。
1材料与方法
1．1实验材料人肺腺癌细胞株HCC4006由南方医科大学惠赠；HCC4006于含10%FBS、1%青霉素链霉素的ＲPMI1640培养基中，置于37ħ、5%CO
2培养箱内培养，4d左右传代1次。厄洛替尼、阿伐替尼分别由瑞士罗氏公司、德国勃林格殷格翰公司赠予；分别使用DMSO溶解成8mmol/L、20mmol/L 浓度备用。使用抗体如下：鼠抗人N－cadherin（sc－8426，Santa Cruz）、鼠抗人ESＲP1/2（210－301－c31，Ｒockland）、兔抗人ZEB1（3396，Cell Signaling）、鼠抗人N－cadherin（sc－8424，Santa Cruz）、vimentin （ab137321，Abcam）；辣根过氧化酶标记鼠抗（31420）及兔抗（A18903）IgG二抗，ECL显色试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。
1．2耐药细胞株的构建梯度递增使用2nmol/L、20nmol/L、200nmol/L、2μmol/L、8μmol/L浓度的厄洛替尼处理HCC4006细胞，药物处理72h后更换为不含药物培养基，待细胞生长至80%满盘时再次使用药物处理，当细胞在该浓度药物作用下生长速度接近HCC4006母代细胞时升级为下一浓度梯度；耐受8μmol/L厄洛替尼浓度的HCC4006细胞，持续维持在含8μmol/L厄洛替尼的培养基培养并传代10代以上，视为HCC4006厄洛替尼耐药细胞株，即HCC4006EＲ。
1．3MTT法检测药物对细胞的增殖抑制参考文献报道厄洛替尼、阿伐替尼用药浓度梯度分别为5、15、45、135、405、1215nmol/L和3、9、27、81、243、729 nmol/L［4］。MTT实验方法如下：收集对数期细胞，
DOI:10.13820/ki.gdyx.2018.s1.010
△通信作者。E－mail：yijiqun@139．com
计数，96孔板中每孔加入1000个细胞，细胞悬液体
积为100μL ；37ħ、
5%CO 2培养箱内培养过夜，细胞贴壁后加入浓度梯度的药物，每孔100μL ，设4个复孔；37ħ、5%CO 2培养箱内培养72h ，显微镜下观察药物对细胞的增殖抑制；药物作用72h 后每孔
加入20μL MTT 溶液（5mg /mL ，即0.5%MTT ），继续培养4h ；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔
加入150μL 二甲基亚砜，
置摇床上低速振荡10min ，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm 处测量各孔的吸光值；同时设置对照孔（细胞、培养液、
MTT 、DMSO ）；以上实验重复3次；计算增殖抑制率及半数抑制浓度IC 50值。IC 50计算公式如下：lgIC 50=Xm －I ［
P －（3－Pm －Pn ）/4］。其中：Xm ：lg 最大剂量；I ：lg （最大剂量/相临剂量）；P ：阳性反应率之和；Pm ：最大阳性反应率；Pn ：最小阳性反应率；公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率。耐药指数=HCC400EＲ细胞IC 50值/HCC4006细胞IC 50值。1．4
免疫印迹法检测蛋白表达用细胞裂解液分
别处理收集的HCC400、HCC4006EＲ，提取细胞总蛋
白，
用BCA 法测定蛋白浓度。各组细胞总蛋白经常规变性后，用8%或12%SDS －PAGE 分离目的蛋白，
然后采用湿转印法将蛋白转印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride ，PVDF ）膜上；用5%脱脂牛奶于室温封闭1h ，加入兔/鼠抗人抗体（1ʒ1000），4ħ反应过夜；TBST 洗膜后，加入HＲP 兔/鼠IgG 二抗（1ʒ3000），室温反应1h ；洗膜后，采用ECL 试剂检测不同细胞组中EMT 标志的表达水平，以actin 为内参蛋白进行校正。1．5
统计学方法
计量资料采用珋x ʃs 表示，采用
微软excel 2016软件进行绘图及计算。2结果
2．1
厄洛替尼对HCC400EＲ细胞的增殖抑制通
过MTT 法检测厄洛替尼对HCC4006及HCC400EＲ
的增殖抑制作用，发现HCC4006EＲ对厄洛替尼获得显著的抗性，其IC 50值分别为（11393.33ʃ
18.95）nmol /L 、
（43.68ʃ0.34）nmol /L ；HCC400EＲ对厄洛替尼的IC 50值是其亲本细胞HCC4006的
31.90倍。见图1－A 和表1。2．2
阿伐替尼对HCC400EＲ细胞的增殖抑制阿伐替尼作为第2代EGFＲ－TKI ，对HCC400EＲ的增
殖抑制作用也受到影响；增殖抑制曲线表明，HCC4006EＲ及HCC4006对阿伐替尼的敏感性存在显著差异；发现HCC4006EＲ对厄洛替尼获得显著
的抗性，
其IC 50值分别为（1201.90ʃ7.89）nmol /L 、（4.64ʃ0.29）nmol /L ；HCC400EＲ对阿伐替尼的耐
药指数高达258.78倍。见图1－B 和表1。2．3
HCC4006EＲ细胞形态学改变
通过厄洛替尼
梯度浓度递增处理后的HCC4006耐药细胞株，
即HCC4006EＲ较其母代细胞HCC4006呈现出不同的细胞表型；显微镜下观察HCC4006细胞形态多为
类椭圆形的典型上皮细胞形态，
而HCC4006EＲ呈现逐渐向长梭形形态改变且连接松散，符合间质细
胞形态学改变。见图2。2．4
上皮间质转化标志在HCC400EＲ及HCC4006中的表达使用免疫印迹法检测HCC400EＲ及HCC4006中上皮标志CDH1、ESＲP1/2及间质标志ZEB1、CDH2、vimentin 的蛋白水平，发现上皮标志在耐药细胞株HCC400EＲ中明显下降，而间质标志均有升高。见图3
。
图1厄洛替尼、阿伐替尼浓度－细胞增殖抑制率曲线图
3讨论
EGFＲ突变作为肺腺癌最常见的驱动基因事
件，靶向EGFＲ基因的EGFＲ－TKI 治疗是晚期肺癌药物治疗领域近10余年来的突破性进展，极大地改善了晚期肺癌患者的生存及预后。EGFＲ突变常见
的有19del 、21L858Ｒ、20ins 等，其中治疗效果最佳
的为19del 突变。而EGFＲ－TKI 药物已经历如下
的发展历程：非共价抑制剂（第1代）、共价抑制剂（第2代）、野生型及特定突变型（20T790M ）有效的第3代药物。目前临床使用最为广泛的是第1代药物，中位无进展生存时间（PFS ）为8 10个月，而奥
