Notchl及其配体Jaggedl在小鼠颌下腺胚胎发育中的表达

北京口腔医学２０１３年第２１卷第３期Ｂｅ　ｉｎｇ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ　Ｊｕｎｅ　２０１３，　．２１　．　Ｎｏｔｃｈｌ及其配体Ｊａｇｇｅｄ１在小鼠颌　下腺胚胎发育中的表达　

王学玖葛丽华宿颖　张春梅　【摘要】　目的　探讨Ｎｏｔｅｈｌ及其配体Ｊａｇｇｅｄｌ在小鼠颌下腺胚胎发育过程中的组织学分布。方法　制作　ＩＣＲ小鼠颌下腺不同发育阶段的冰冻组织切片，对小鼠颌下腺自始基至出生后２ｄ不同发育阶段组织的Ｎｏｔｃｈ１和　Ｊａｇｇｅｄｌ的分布情况进行免疫组织化学染色。结果　Ｎｏｔｃｈｌ在小鼠颌下腺发育的蕾状期和假腺管期上皮很少表　达。从微管期早期开始，在顶端胚芽上皮中强表达，而在导管上皮中未见表达。在微管期后期，顶端胚芽上皮部分　细胞Ｎｏｔｃｈｌ仍强表达，部分细胞表达减弱。自终末分化期开始，导管上皮开始表达Ｎｏｔｃｈｌ，而分化完成的腺泡中只　有少量细胞仍表达Ｎｏｔｃｈ１。在Ｎｏｔｃｈ１表达细胞群的周围细胞有Ｊａｇｇｅｄｌ表达。结论　Ｎｏｔｃｈ１可能在小鼠颌下腺　发育过程中的细胞分化以及分化完成后维持干细胞的稳定性方面有重要作用。　【关键词】Ｎｏｔｃｈｌ；颌下腺发育；细胞分化；干细胞　【中图号】　Ｒ３２１．５　【文献标识码】　Ａ【文章编号】　１００６－６７３Ｘ（２０１３）０３－０１４３－０４　

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈｌ　ａｎｄ　Ｊａｇｇｅｄｌ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｇｌａｎｄ　ＷＡＮＧ　Ｘｕｅ一　乱，ＧＥ　Ｌｉ—Ｈｕａ，ＳＵ　ｎｇ，　ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｕｎ—Ｍｅｉ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００５０，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈｌ　ａｎｄ　Ｊａｇｇｅｄｌ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｇｌａｎｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｇｌａｎｄ　ｏｆ　ＩＣＲ　ｍｏｕｓｅ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｔａｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｍａｄｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈｌ　ａｎｄ　Ｊａｇｇｅｄｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｇｌａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｎｏｔｃｈｌ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｌｉｔｔｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　ａｔ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｂｕｄ　ｓｔａｇｅ　ａｎｄ　ｐｓｅｕｄｏｇｌａｎｄｕｌａｒ　ｓｔａｇｅ．Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｅａｎａｌｉｅｕｌａｒ　ｓｔａｇｅ　ｏｎ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈｌ　ｗｅｒｅ　ｓｅｅｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｅｎｄ　ｂｕｄｓ，ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｕｃｔｓ．Ａｔ　ｌａｔｅ　ｅａｎａｌｉｅｕｌａｒ　ｓｔａｇｅ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｏｔｃｈ１　ｗａｓ　ｓｔｉｌｌ　ｓｔｒｏｎｇ　ｉｎ　ｓｏｍｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｅｎｄ　ｂｕｄｓ．ｂｕｔ　ｗｅａｋ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｃｅｌｌｓ．Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｇｌａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｅｒｍｉｎａ１　ｂｕｄ　ｓｔａｇｅ，ｔ｝ｌｅ　ｄｕｃｔ　ｃｅｌｌｓ　ｂｅｇａｎ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｎｏｔｃｈ１．ｗｈｉｌｅ　ｔＩｌｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｏｎｌｙ　ｓｍａｌｌ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ａｃｉｎｉ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｎｏｔｃｈ１．Ｊａｇｇｅｄｌ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ　ｔｈｅ　Ｎｏｔｃｈｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ　Ｎｏｔｃｈｌ　ｍｉｇｈｔ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏ￣ａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｃｉｎｉ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｇｌａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕｅ　ｔｏ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ｏｆ　ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｇｌａｎｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｈａｓ　ｆｉｎｉｓｈｅｄ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｎｏｔｃｈ１；Ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｇｌａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｃｅｌｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；Ｓｔｅｍ　ｃｅｌ１．　

和许多其它器官的发育过程类似，小鼠颌下腺　发育包括始基发生、分支形态发生、腺管形成和细胞　分化等阶段＿１　Ｊ。在这些发育过程中，多个分子信号　系统参与了细胞的增殖、迁徙和分化等，诸如ＴＧＦ、　ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ等　Ｊ。在成体颌下腺组织，结扎　导管等实验可激发其固有的干细胞或前体细胞分化　为功能细胞＿４　Ｊ。了解颌下腺发育的分子机制及胚　胎向成体组织发育过程中干细胞来源的谱系追踪，　有利于利用可靠标记物分离干细胞再生颌下腺的功　能。已知Ｎｏｔｃｈ１在神经、造血等多个系统发育的细　基金项目：国家科技部资助（２０１０ＣＢ９４４８０１）　作者单位：１０００５０北京首都医科大学口腔医学院口腔颌面外科　（王学玖），口腔医学研究所（葛丽华、宿颖、张春梅）　通讯作者：王学玖，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘａｅｊｉｕ９６９＠１６３．ｃｏｍ，电话：０１０．　５７０９９１５７　胞分化方面有关键作用，并在系统发育成熟后继续　维持这些组织干细胞池的稳定。曾有学者证实人类　涎腺细胞系细胞表达Ｎｏｔｃｈ１　，但目前仍无Ｎｏｔｃｈ１　在颌下腺发育中相关作用的报道。本研究利用免疫　组化的方法探讨Ｎｏｔｃｈ１和其配体Ｊａｇｇｅｄｌ在小鼠颌　下腺各个发育阶段的分布，为进一步研究此信号通　路在颌下腺发育中的作用打下基础。　

材料和方法　１．材料　怀孕１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１６．５、１８．５ｄ（发现　阴栓的当天计为０．５ｄ）ＩＣＲ孕鼠和出生后２ｄ的ＩＣＲ　仔鼠（购自北京大学医学部实验动物科学部）。一　抗：兔抗小鼠Ｎｏｔｃｈｌ多克隆抗体（英国Ａｂｃａｍ公　司，ａｂ２７５２６）；山羊抗小鼠ｊａｇｇｅｄｌ多克隆抗体　（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，ＳＣ．３４４７３）。二抗：生物素标记驴　京口腔医学２０１３年第２１卷第３期Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｔｏｍａｔｏｌｏ￣Ｊｕｎｅ　２０１３，Ｖｏ１．２１，Ｎｏ．３　抗兔多克隆ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ公司，ａｂ６８０１）；Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４荧光标记鸡抗山羊二抗（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公　司，Ａ￣２１４６８）。三抗：ＮＬ４９３荧光标记链霉亲和素　（美国Ｒ＆Ｄ公司，ＮＬ９９７）；辣根过氧化物酶标记链　霉亲和素（武汉博士德生物工程有限公司，ＳＡ１０２１　试剂盒）。ＤＡＢ显色剂（福州迈新生物技术开发有　限公司，ＤＡＢ－２０３１）；抗荧光淬灭水性封片剂（丹麦　Ｄａｋｏ公司，￥３０２３）。　２．方法　冰冻切片制作：颈椎脱臼法处死孕鼠，剖开子宫　取出胎鼠，切离头部，４％多聚甲醛固定６～２４ｈ。仔　鼠则直接切离头部，４％多聚甲醛固定２４ｈ。然后以　２５％蔗糖溶液处理过夜。头部制作１０ｕｍ冰冻组织　切片。　Ｎｏｔｃｈ１　ＤＡＢ显色单染方法：切片ＰＢＳ（ｐＨ７．２）　洗５ｍｉｎ×２次，１０％马血清３７ｃＩ＝封闭３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗　５ｍｉｎ×３次，一抗孵育４℃过夜（浓度为ｌ：１００），ＰＢＳ　洗５ｍｉｎ×３次，二抗（生物素标记驴抗兔多克隆　ＩｇＧ，浓度为１：１００）室温孵育３０ｒａｉｎ。ＰＢＳ洗５ｍｉｎ×　３次，三抗（辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，工作　液）室温孵育１５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗５ｍｉｎ×４次。ＤＡＢ显微　镜下显色至满意，苏木素复染细胞核，酒精梯度脱　水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜（奥林　巴斯ＢＸ５１）观察、照相。　Ｎｏｔｃｈｌ、Ｊａｇｇｅｄｌ荧光双染方法：切片ＰＢＳ　（ＰＨ７．２）洗５ｍｉｎ×２次，５％小牛血清３７℃封闭　３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗５ｍｉｎ×３次，混合一抗（将两个一抗混　合稀释）孵育４ｃＩ＝过夜（浓度均为１：１００），ＰＢＳ洗　５ｒａｉｎ×３次，混合二抗（浓度均为１：２００）室温孵育　３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗５ｍｉｎ×３次，三抗（ＮＩＡ９３荧光标记链　霉亲和素，１：３ｏｏ０）室温孵育１５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗５ｍｉｎ×４　次，蒸馏水洗３ｒａｉｎ，抗荧光淬灭水性封片剂封片，激　光共聚焦显微镜（１ｅｉｃａ　ＴＣＳ　ＳＰ５）观察、照相。　结　果　１．ＤＡＢ显色单染Ｎｏｔｃｈｌ结果　胚胎１１．５ｄ（蕾状期）：颌下腺上皮始基呈棒球　状，向间充质中生长，末端膨大。可发现上皮蕾中无　明显阳性信号，上皮蕾上方的口腔上皮的表层细胞　有少量表达，上皮蕾周围的间充质中也有少量细胞　表达。　・　胚胎１２．５０（假腺管期早期）：颌下腺始基上皮　条索末端膨大部分周边开始出现分叉，可见上皮蕾　上方口腔上皮中有部分细胞表达Ｎｏｔｃｈｌ，但上皮蕾　边缘上皮未见明显表达，其内侧上皮中有少量细胞　表达。上皮蕾周围的间充质中有少量细胞表达。　胚胎１３．５ｄ（假腺管期晚期）：此时可见颌下腺　上皮条索球状末端上皮分叉进一步明显，这些分叉　的上皮蕾边缘上皮内有部分上皮细胞表达Ｎｏｔｃｈ１，　临近上皮蕾边缘的问充质细胞也有表达，再向外的　间充质细胞不表达，一段距离之后的问充质细胞又　出现表达；而上皮蕾和间充质相邻的边缘上皮细胞　表达较弱。　胚胎１４．５ｄ（微管期早期）：可见分枝状上皮条　索和顶端胚芽进一步增多，尽管某些上皮结构中央　部位的上皮细胞开始变得稀疏，但仍未有明显管腔　形成。此阶段Ｎｏｔｃｈ１在顶端胚芽部位强表达。但　分支导管细胞无阳性信号（图１Ａ）。　胚胎１６．５ｄ（微管期晚期）：可见一部分上皮条　索已形成中空结构，周围为复层上皮细胞围绕，顶端　胚芽增大，其周围细胞开始排列成类圆形，中央细胞　变得进一步稀疏，有些中央细胞消失，周围围绕单层　上皮细胞。此时可见顶端胚芽部分细胞强表达　Ｎｏｔｃｈｌ，而部分细胞表达减弱，和微管期早期一样，　分支导管细胞不表达（图１Ｂ）。　胚胎１８．５ｄ（终末分化期）：很多腺泡结构或闰　管结构已经形成，导管腔变大，周围为立方状细胞围　绕。此时可见部分导管细胞已开始表达Ｎｏｔｃｈｌ，已　经分化的腺泡只有少量细胞表达，正在进行分化的　腺泡仍有部分细胞表达（图１Ｃ）。　出生后２ｄ（终末分化期）：此时，颌下腺进一步　发育，大部分颌下腺结构已经成形。可见导管细胞　强表达Ｎｏｔｃｈ１，在分化的腺泡边缘仍有少量细胞表　达（图１Ｄ）。　２．Ｎｏｔｅｈｌ和Ｊａｇｇｅｄ１荧光双染色结果　在Ｅｌ４至Ｅ１８阶段，Ｎｏｔｃｈ１在细胞团中心部分　表达，而Ｊａｇｇｅｄｌ在细胞团周围细胞表达。Ｐ２阶段　染色显示，导管细胞表达Ｎｏｔｅｈｌ而其周围细胞表达　Ｊａｇｇｅｄ１（图２）。