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小鼠胚胎操作实验手册小鼠胚胎操作实验手册目录1. 引言1.1 胚胎操作实验的意义1.2 实验前的准备工作2. 实验器材和试剂准备2.1 实验器材清单2.2 试剂准备和储存要点3. 小鼠胚胎操作步骤3.1 小鼠交配和胚胎收集3.2 胚胎培养和处理3.3 胚胎移植和植入3.4 胚胎标记和观察4. 数据记录和结果分析4.1 数据记录要点和格式4.2 结果分析和统计方法5. 安全注意事项和实验规范5.1 生物安全操作要求5.2 实验规范和伦理要求6. 实验故障排除和常见问题解决6.1 常见操作问题和解决方案6.2 实验故障排除建议7. 参考文献和扩展阅读7.1 相关研究文献推荐7.2 扩展阅读和资源推荐引言1.1 胚胎操作实验的意义胚胎操作实验是研究胚胎发育和基因功能的重要手段，通过对小鼠胚胎的操作和处理，可以揭示胚胎发育的机制和影响因素。
1.2 实验前的准备工作在进行胚胎操作实验之前，需要进行充分的准备工作，包括实验器材和试剂的准备、实验操作流程的熟悉、实验动物的选取和饲养等。
实验器材和试剂准备2.1 实验器材清单列举常用的器材和仪器，并说明其用途、规格和供应商信息，包括显微镜、离心机、培养皿、吸管、移液器等。
2.2 试剂准备和储存要点介绍常用的试剂，包括培养基、胚胎染色剂、抗体等，说明其配制方法、储存条件和稳定性要求。
小鼠胚胎操作步骤3.1 小鼠交配和胚胎收集阐述小鼠交配的方法和时间安排，以及胚胎的收集和处理步骤，包括解剖、体外培养和胚胎筛选等。
3.2 胚胎培养和处理详细描述胚胎的培养方法和处理步骤，如细胞培养、转染、基因敲除、基因表达等实验操作。
3.3 胚胎移植和植入介绍胚胎移植和植入的方法和注意事项，包括手术操作、不同器官的移植方式和移植成功率的评估等。
3.4 胚胎标记和观察说明如何对胚胎进行标记和观察，包括荧光染料标记、显微镜观察和胚胎发育阶段的划分等。
数据记录和结果分析4.1 数据记录要点和格式指导实验者如何记录实验过程中的数据和结果，包括实验条件、样本信息、实验数据和观察结果等，并规范化数据记录格式。
小鼠成长计划书1. 引言小鼠作为一种常见的实验动物，其生长发育阶段对于生物学研究具有重要意义。
本文档旨在提供一份小鼠成长计划书，以帮助研究人员更好地了解小鼠的成长过程和相关实验设计。
2. 小鼠的生长发育阶段小鼠的生长发育阶段主要分为胚胎期、初生期、幼年期、青年期和成年期。
具体的发育时间和特点如下：•胚胎期：从受精到出生，约为19-21天。
在此阶段，小鼠的器官和组织开始形成，神经系统和肌肉系统的发育突出。
•初生期：出生后的第1-2周。
小鼠身体逐渐适应外界环境，开始进行吸食和排泄。
•幼年期：第3-4周到第6-8周。
小鼠的生长速度加快，体重迅速增加，开始进行独立进食，并且有学会追逐和玩耍的行为。
•青年期：第8周到第16周。
小鼠的生长速度逐渐减缓，体重增长趋于稳定，性成熟开始出现。
•成年期：第16周以后。
小鼠达到生殖能力的完全成熟，维持体重和生长速度的平衡。
3. 小鼠成长的环境要求在小鼠成长过程中，提供良好的环境对其健康和正常发育至关重要。
以下是小鼠成长过程中的环境要求：3.1 温度和湿度小鼠对温度和湿度都非常敏感，需要在适宜的环境下生长。
一般来说，小鼠的舒适温度范围为20-26摄氏度，相对湿度在30％-70％之间。
3.2 日夜节律小鼠是夜行性动物，它们有明显的昼夜节律。
因此，为了保持小鼠的生物钟节律和正常行为，提供稳定的光照和黑暗周期是必要的。
一般建议使用12小时的光照和12小时的黑暗。
3.3 饮食小鼠需要提供均衡营养的饮食以支持其生长发育。
常用的小鼠饲料包括小鼠粮和蔬菜水果等。
此外，确保水源的干净和充足也是必要的。
3.4 社交环境小鼠是社交性动物，需要与同类保持一定社交互动。
因此，建议将小鼠群体放置在适宜大小的笼子中，以提供良好的社交环境和空间。
4. 进行小鼠相关实验的注意事项在进行小鼠相关实验时，需要注意以下事项：4.1 预实验准备在开始实验前，需要对小鼠进行特定的预实验准备，包括饲养条件、实验目的、实验操作步骤等。
动物胚胎培育技术的操作指南随着科学技术的不断发展，动物胚胎培育技术在畜牧业和生物医学领域扮演着重要的角色。
胚胎培育技术可以帮助我们研究生殖生物学、改良家畜品种，甚至是克隆动物。
在这篇文章中，我们将介绍动物胚胎培育技术的操作指南，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
胚胎培育技术主要包括体外受精（IVF）和胚胎移植两个步骤。
在体外受精阶段，首先需要从母体动物中收集卵子和精子。
对于较大的动物，如牛、猪和马，可以通过超声波引导下的卵巢穿刺采集卵子。
对于较小的动物，如小鼠或小鸟，可以通过解剖手术或通过特殊仪器采集卵子。
精子可以通过自然排出或通过人工方式采集。
采集到卵子和精子后，需要进行体外受精。
首先，将卵子和精子放入含有适当培养液的离心管中。
然后，通过离心或通过特殊仪器的帮助，使卵子和精子接触，促进受精的发生。
接下来，将受精卵转移到培养皿中，并将其置于恒温灭菌的培养箱中。
培养皿中的培养液需要定期更换，以提供所需的营养物质和生长因子。
胚胎培养的下一步是胚胎移植。
胚胎移植是将成熟的胚胎植入到母体动物的子宫内，使其继续发育。
在进行胚胎移植前，需要将母体动物的子宫内膜准备好，以提供适宜的环境供胚胎着床。
这可以通过激素治疗或手术操作来实现。
在胚胎移植过程中，需要将培养的胚胎转移到母体动物的子宫内。
这可以通过经阴道插管或腹腔手术来完成。
移植后，需要密切观察胚胎在母体内的发育情况。
一些胚胎可能无法成功着床或在早期发展阶段产生问题，这是正常现象。
但一旦胚胎着床成功并进一步发育，将会带来新生仔动物。
动物胚胎培育技术的操作需要具备一定的专业知识和技能。
操作时，需要注意保持手术场所的清洁和无菌，以避免感染。
培养液的配制和保存也需要严格按照制定的方案进行。
此外，在胚胎移植过程中，要小心处理胚胎，以防止对其造成损伤。
动物胚胎培育技术的应用十分广泛。
不仅可以帮助畜牧业提高品种质量和数量，还可以为生物医学领域提供重要的研究工具和资源。
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学学生姓名学生学号指导教师XXXX年XX月XX日小鼠早期胚胎发育的研究一、引言胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。
而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。
动物胚胎的发育过程虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。
此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。
受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。
它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界，卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。
在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。
在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。
不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。
如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。
原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。
原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。
一、实验目的1. 掌握小鼠胚胎的采集方法。
2. 了解小鼠胚胎的发育过程。
3. 培养实验操作技能。
二、实验原理小鼠胚胎的获得是通过人工操作，将雌鼠的受精卵取出，进行体外培养，直至发育成胚胎。
该实验旨在研究小鼠胚胎的发育过程，为后续的胚胎移植、基因编辑等研究提供基础。
三、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠、雄性小鼠2. 实验仪器：显微镜、解剖显微镜、培养箱、离心机、培养皿、手术器械等3. 实验试剂：生理盐水、DEPC水、培养液、抗凝剂、消毒剂等四、实验步骤1. 实验动物处理（1）将雌性小鼠和雄性小鼠分别饲养于清洁、通风的动物房中，保持适宜的饲养条件。
（2）雌性小鼠和雄性小鼠分别进行交配，交配后观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。
2. 胚胎采集（1）雌性小鼠交配后第2天，用解剖显微镜观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。
（2）雌性小鼠交配后第3天，将雌性小鼠麻醉，固定于解剖显微镜下。
（3）用手术器械取出雌性小鼠的子宫，置于培养皿中。
（4）在解剖显微镜下，用镊子取出受精卵，置于培养皿中。
3. 胚胎培养（1）将受精卵放入培养箱中，在37℃、5%CO2、95%空气的条件下培养。
（2）观察受精卵的发育过程，记录胚胎的形态变化。
4. 实验结果分析（1）观察胚胎的发育过程，记录胚胎的形态变化。
（2）分析胚胎发育过程中各阶段的形态特征。
五、实验结果1. 胚胎发育过程（1）受精卵在培养箱中培养24小时后，可见胚胎开始分裂。
（2）培养24小时后，胚胎发育至桑椹胚阶段。
（3）培养48小时后，胚胎发育至囊胚阶段。
（4）培养72小时后，胚胎发育至原肠胚阶段。
2. 胚胎形态特征（1）受精卵：透明、圆形，直径约100μm。
（2）桑椹胚：细胞数目增多，排列紧密，形成桑椹状。
（3）囊胚：细胞分化明显，形成囊胚腔。
（4）原肠胚：细胞分化更加明显，形成原肠。
六、实验结论1. 通过人工操作，成功获得小鼠胚胎。
2. 小鼠胚胎在体外培养过程中，经历了受精卵、桑椹胚、囊胚、原肠胚等阶段。
采集小鼠受精卵小鼠受精卵（早期胚胎）采集在基因工程小鼠的制备和保种中都是非常重要的步骤。
只有采集到足够数量和质量的受精卵，才能更有效地进行显微注射、胚胎移植或冻存复苏，保证获得高质量的子代小鼠。
那么受精卵到底是怎么采集的呢？今天我们就来介绍一下1细胞期与2细胞期胚胎的收集方法。
哺乳动物的受精过程发生在输卵管内，小鼠胚胎进入子宫着床时间大约为4天左右。
因此，需要在配种后或受精后的适当时间从超排供体收集不同时期的胚胎。
小鼠受精后4.5天内早期胚胎发育的过程：[图片来自：Genetics & Development]人、小鼠、大鼠胚胎发育阶段对应时间点：[图片来自：https://.au]受精卵获得的方法分自然排卵、激素诱发排卵和体外受精三种方法。
我们今天介绍的是诱发排卵（超排）后采集受精卵的方法。
雌鼠超排与合笼超排不同背景的小鼠超排周龄都是不同的，剂量也是不同的。
那以常用的C57小鼠为例，超排周龄为3-4周龄。
当达到超排周龄后，向雌小鼠腹腔内注射5个国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)，然后约46-48h后再注射5 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，12h后即可诱发排卵。
图1. 雌鼠超排与受精卵早期发育时间轴[图片来自：Ivan Bedzhov, et al. In vitro culture of mouse blastocysts beyond the implantation stages. Nature Protocols volume 9, pages 2732–2739 (2014)]合笼1）雌小鼠给予hCG后与成熟雄性小鼠进行合笼。
雄鼠交配一般是在夜晚发生，交配过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。
2）交配后过夜易见小鼠的阴道栓。
1-cell期胚胎采集输卵管切开1）通过断颈快速处死见栓0.5天的小鼠。
2）将小鼠背部靠尾部剃毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。
低氧及常氧条件下不同品系小鼠体外受精胚胎发育及妊娠结局观察陈美婷，朱怡卿，刘梦，王芳，黄金凤，肖邦海军军医大学医学遗传学教研室，上海200433摘要：目的 比较不同品系小鼠来源胚胎在低氧条件（5% O 2）及常氧条件（20% O 2）下体外发育情况和妊娠结局，探讨适用于评价人类体外受精实验室质量控制的体系。
方法 KM 小鼠、ICR 小鼠、C57BL /6J 小鼠、BALB /c 小鼠各20只，雌雄各半。
取四种品系雌性小鼠各10只常规促排卵，取卵后每个品系小鼠均随机分为低氧组与常氧组分别进行培养，进行体外受精及胚胎移植，观察并比较两组各品系小鼠囊胚形态结构、正常受精率、体外受精第2天（D2）卵裂率、D2优质胚胎率、D3优质胚胎率、囊胚率、新鲜移植妊娠率、解冻移植妊娠率。
结果 与常氧组比较，低氧组KM 小鼠、ICR 小鼠、C57BL /6J 小鼠、BALB /c 小鼠囊胚体外培养均呈中空球形，囊胚均具有更加规则的形状和更高的折光度。
低氧组KM 小鼠、ICR 小鼠、C57BL /6J 小鼠、BALB /c 小鼠囊胚率、新鲜移植妊娠率、解冻移植妊娠率均高于常氧组（P 均<0.05），两组四个品系小鼠正常受精率、D2卵裂率、D2优质胚胎率、D3优质胚胎率比较均无统计学意义。
结论 低氧条件下胚胎体外培养可提高KM 小鼠、ICR 小鼠、C57BL /6J 小鼠、BALB /c 小鼠胚胎体外发育潜能、改善妊娠结局。
关键词：低氧；体外受精；胚胎体外发育；妊娠结局；小鼠品系doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.17.002中图分类号：R715.5 文献标志码：A 文章编号：1002-266X （2023）17-0006-05Embryo development and pregnancy outcome of different strains of mice after in vitro fertilization under hypoxic or normoxic conditionsCHEN Meiting ， ZHU Yiqing ， LIU Meng ， WANG Fang ， HUANG Jinfeng ， XIAO Bang Department of Medical Genetics ， Naval Military Medical University ， Shanghai 200433， ChinaAbstract ： Objective To compare the in vitro development and pregnancy outcome of embryos from different strains of mice under hypoxia （5% O 2） and normoxia （20% O 2） for exploring a suitable system for evaluating the quality control of human in vitro fertilization laboratory. Methods Twenty KM mice ， 20 ICR mice ， 20 C57BL /6J mice ， and 20 BALB /c mice ， with half males and half females ， were selected. Forty adult female mice with 10 mice in each strain received rou‐tine ovulation promotion. After ovulation ， mice of each strain were randomly divided into the hypoxia group and normoxia group for culture ； in vitro fertilization and embryo transfer were conducted. Blastocyst morphology ， normal fertilization rate ， cleavage rate of in vitro fertilization on day 2 （D2）， D2 high -quality embryo rate ， D3 high -quality embryo rate ， blas‐tocyst rate ， fresh pregnancy rate ， and frozen -thawed transfer pregnancy rate of mice of each strain in the two groups were observed and compared. Results Compared with the normoxia group ， the blastocysts of KM mice ， ICR mice ， C57BL /6J mice and BALB /c mice in the hypoxia group were all hollow and spherical ， and had more regular shape and higher refrac‐tive power. The blastocyst formation rate ， fresh transfer pregnancy rate and frozen -thawed transfer pregnancy rate of four strains in the hypoxia group were significantly higher than those in the normoxia group （all P <0.05）. There were no signifi‐cant differences in normal fertilization rate ， D2 cleavage rate ， D2 high -quality embryo rate ， or D3 high -quality embryo rate of four strains of mice between hypoxia group and normoxia group （all P >0.05）. Conclusion Embryo in vitro culture un‐der hypoxic condition can enhance the in vitro developmental potential of embryos from KM mice ， ICR mice ， C57BL /6Jmice ， and BALB /c mice ， and improve pregnancy outcomes.Key words ： hypoxia ； in vitro fertilization ； embryonic development in vitro ； pregnancy outcome ； strains of mice基金项目：国家自然科学基金资助项目（82201789，81971337）；上海市自然科学基金资助项目（22ZR1477000）。
基因工程基因工程特别提醒：1.哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备,是在出生前(即胎儿时期)完成的,这是精子和卵子在发生上的重要区别,但不是唯一的区别,如发生场所、过程及结果也不相同。
2.精子的发生中两次减数分裂是连续的,是在睾丸的曲细精管内进行的。
卵子的发生中两次减数分裂是不连续的,减数第一次分裂在卵巢内完成,产生一个次级卵母细胞和第一极体,进入输卵管,在与精子的结合过程中完成减数第二次分裂,产生一个成熟的卵子和第二极体。
当原核融合时,第一极体完成分裂,形成2个第二极体。
有的哺乳动物的第一极体不再分裂。
3.不同种动物精子的形态相似,大小略有不同,但与动物的体型大小无关。
4.哺乳动物卵巢、卵泡和卵子的关系卵巢是卵子形成、卵泡存在的场所,内部包含许许多多不同发育阶段的卵泡,而成熟的卵泡中可释放出卵子,其中卵子的外面有辅助结构——透明带,由卵丘细胞(卵泡细胞)形成放射冠,而卵子外面的胞膜即卵黄膜。
排卵指卵子从卵泡中排出,而非卵泡从卵巢中排出。
5.受精的标志是在透明带和卵黄膜之间观察到两个极体;而受精完成的标志为雌雄原核的融合。
6.体外受精时,精子与卵子在体外结合前,需要对精子进行获能处理,并将卵母细胞培养成熟至减数第二次分裂中期。
7.胚胎发育的起点是受精卵,发育过程中的细胞分裂均为有丝分裂。
8.桑椹胚细胞仍具有全能性,是胚胎分割的最佳时期。
9.囊胚是开始分化的阶段,分化为滋养层细胞——发育成胎膜和胎盘等结构和内细胞团细胞——发育成胎儿,该阶段还可进行胚胎分割。
10.孵化——囊胚后期,透明带破裂,胚胎伸展出来;原肠胚早期还保留缩小的囊胚腔,最后消失。
11.冲卵含义:冲出早期胚胎,不是冲出卵子。
12.受精的标志和受精完成的标志不是一回事。
13.胚胎发育过程中开始分化的阶段是囊胚,可以移植或分割的阶段为桑椹胚和囊胚。
14防止多精入卵的两道屏障的名称——透明带反应和卵细胞膜反应。
页脚内容。
小鼠胚胎移植操作步骤小鼠胚胎移植操作步骤如下：
1.准备工具和材料：包括显微操作器械、胚胎移植管、显微镜、培养皿、培养
液、胚胎等。
2.显微操作：在显微镜下，用显微操作器械将胚胎从供体鼠输卵管中取出，放
入培养皿中。
3.胚胎培养：将胚胎放入培养液中，在恒温培养箱中进行培养，保持适宜的温
度和湿度，等待胚胎发育到适合移植的阶段。
4.移植前准备：将受体鼠麻醉，切开子宫口，露出子宫颈。
5.胚胎移植：将培养好的胚胎用移植管轻轻送入受体鼠的子宫内，确保胚胎能
够顺利着床。
6.缝合伤口：用缝合线缝合子宫口，确保伤口不会漏液或出血。
7.术后护理：将受体鼠放回笼中，注意观察其身体状况，及时处理任何异常情
况。
在整个操作过程中，需要注意以下几点：
1.操作前要对手部进行消毒，确保无菌操作。
2.胚胎移植时要轻柔、准确，避免对胚胎造成损伤。
3.术后要给受体鼠提供适宜的环境，保证其身体健康。
4.在整个过程中要严格遵守实验室规定，确保实验安全。
通过以上步骤，可以完成小鼠胚胎移植操作。
这个技术可以用于研究胚胎发育、繁殖生物学等领域，对于提高动物的繁殖效率和推动相关领域的发展具有重要意义。
小鼠胚胎培养方法的研究摘要目的：探讨小鼠早期胚胎在不同的体外培养液中生长发育的状况，从而寻找胚胎培养的最佳培养体系，为人类胚胎培养方法的改善提供理论依据，以提高临床体外受精一胚胎移植（ＩＶＦ．ＥＴ）的成功率。
方法：配制不同的培养液，对１００例小鼠超排卵共取卵子１６７８枚，分别在不同的培养液中进行体外授精，并将２一细胞鼠胚放入各组培养液中进行培养，其中，血清组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清：卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％人卵泡液；蜕膜细胞条件培养液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加ｌＯ％条件培养液：血清加卵泡液组的培养液为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％人卵泡液：血清加条件培养液组为Ｅａｒｌｅ培养液加１０％人血清和５％条件培养液。
每日在显微镜下观察小鼠胚胎的发育情况，分析受精率、卵山西医科大掌裂率、卵裂速度及桑椹胚与囊胚形成率，采用ｘ２分割检验进行统计分析。
结果：一、１、小鼠胚胎在蜕膜细胞条件培养液中有７２．９％发育到８．细胞期，６６．０％发育到桑椹胚，６１．６％形成囊胚，３２．１％胚胎孵化。
而对照组有４３．６％发育到８．细胞期，３０．９％发育到桑椹胚，１９．１％到初级囊胚，５５％孵化的胚胎。
两组比较有显著性差异。
２、卵泡液的胚胎有７１．３％到８．细胞期，５８８％发育到桑椹胚，５０．Ｏ％形成囊胚，２５７％孵化。
与对照组比较有差显著性异。
３、血清组有５３，４％发育到８．细胞期，４０．５％到桑椹胚，２９．３％形成囊胚，仅有７．８％孵化。
与对照组无显著性差异。
二、鼠卵在不同培养液中受精率无显著性差别，而对于卵裂率和优质胚胎的形成率，鼠卯在蜕膜细胞条件培养液组和卵泡液组中均与对照组有显著性差异，而血清组与对照组比较无差异。
鼠胚在蜕膜细胞条件培养液和卵泡液中培养发育速度快，碎片率明显低于对照者。
三、小鼠早期胚胎在卵泡液组、蜕膜细胞条件培养液组中的调亡速度明显低于对照组，有显著性差异，而血清组中鼠胚的调亡速度低于对照组，但无显著性差异。
小鼠冲胚实验报告实验简介冲胚实验是一种常用的生物学实验方法，用于研究胚胎发育和细胞分化过程。
本次实验旨在观察小鼠胚胎的冲胚过程以及细胞分化情况。
实验方法1. 准备实验材料：小鼠受精卵、培养液、显微镜等。
2. 将小鼠受精卵取出，置于培养液中。
3. 在显微镜下观察受精卵的发育情况，记录观察结果。
4. 利用细胞标记技术，对受精卵的细胞进行染色，并观察细胞分化情况。
5. 分析观察结果，总结并讨论实验结果。
实验观察与结果受精卵的发育情况观察在培养液中观察了大量小鼠受精卵的发育过程。
根据观察，受精卵经历了以下几个关键阶段：1. 受精卵阶段：受精卵呈现为单个细胞状态，其大小约为150至200微米。
2. 二细胞期：受精卵发育成为两个大致相等的细胞，细胞之间有明显的细胞界限。
3. 四细胞期：受精卵进一步分裂，成为四个大小接近的细胞。
细胞排列呈链状分布。
4. 八细胞期：四细胞期的细胞再次分裂，形成多个接近相等的细胞，其中大部分细胞为球状排列。
5. 胚胎球期：细胞继续分裂，形成一个紧密球状的细胞团。
6. 胚泡期：细胞团发生腔化，形成一个中心腔隙的结构。
细胞分化情况观察通过细胞标记技术，我们对冲胚过程中的细胞进行了染色，以观察细胞的分化情况。
染色结果显示，受精卵的细胞在发育过程中逐渐分化成不同类型的细胞，如内胚层细胞、外胚层细胞和间充质细胞等。
结果分析与讨论通过实验观察结果，我们可以得出以下结论：1. 小鼠受精卵经历了一系列的细胞分裂过程，从单个细胞发育为胚胎球期和胚泡期。
2. 冲胚过程中，细胞逐渐分化成不同类型的细胞，为胚胎的进一步发育奠定了基础。
3. 实验结果与先前的研究相符，证实了小鼠的胚胎发育和细胞分化过程。
在实验中，我们也遇到了一些困难。
由于显微镜观察过程中的视野受限，观察和记录过程相对繁琐。
另外，染色技术的操作也需要一定的专业技能。
此外，对于其他因素如培养条件和实验环境等，对实验结果可能会产生一定的影响。
未来的研究中可以进一步深入探究小鼠胚胎发育和细胞分化过程中的分子机制，并结合其他技术手段，如基因编辑技术等，来更加全面地研究胚胎发育和细胞分化的规律。
小鼠胚胎操作手册第三章第三章小鼠胚胎操作手册第一节注射操作在小鼠胚胎培养和研究中，注射是一项关键操作。
正确的注射技术可以确保研究的准确性和成功率。
本节将介绍小鼠胚胎注射的步骤和技巧。
1. 准备工作在进行注射前，确保实验室环境整洁，并准备好所需的实验材料。
这些材料包括显微镜、注射器、胚胎培养培养皿、胚胎移植工具等。
2. 胚胎准备将小鼠产下的胚胎收集到含有去离子水的培养皿中。
使用显微镜观察胚胎的形态和发育情况，并选择符合实验需求的胚胎进行注射。
3. 注射剂准备根据实验需求制备相应的注射剂。
注射剂可以是基因编辑工具，如CRISPR/Cas9系统，也可以是药物或其他化合物。
确保注射剂的浓度和质量符合实验要求。
4. 注射操作将胚胎取出，并放置在培养盐水中以保持湿润。
使用显微镜和细注射器将注射剂缓慢注入胚胎内。
注射时要注意避免损伤胚胎，注入的剂量要准确控制。
5. 胚胎移植完成注射后，将胚胎移植回培养皿中，并放入孵化箱或恒温箱中进行进一步的培养。
确保温度、湿度和氧气供应的稳定。
第二节胚胎培养和观察胚胎培养和观察是小鼠胚胎实验研究中的核心步骤。
本节将介绍胚胎的培养条件和观察方法。
1. 培养条件将注射后的胚胎放置在含有培养基的培养皿中。
培养基应包含足够的养分和生长因子，以满足胚胎的发育需求。
培养皿要保持无菌，并放置在恒温箱中维持稳定的温度。
2. 观察方法使用显微镜观察胚胎的发育情况，并记录下重要的观察结果。
观察胚胎的细胞分裂情况、胚胎囊胚的形成和融合等发育进程。
记录这些数据对于后续的实验分析非常重要。
3. 胚胎存储如果需要长期保存胚胎，可以使用液氮冷冻保存的方法。
在胚胎培养过程中，将胚胎收集到冷冻培养基中，然后放入液氮中冷冻保存。
这样可以保持胚胎的完整性和生理活性。
第三节数据分析和结果解读在小鼠胚胎操作过程中，数据分析和结果解读是至关重要的。
本节将介绍常用的数据分析方法和结果解读的注意事项。
1. 数据分析方法对于进行注射和观察的胚胎数据，可以使用统计学方法进行分析。
小鼠发育生物学实验内容实验一：小鼠卵母细胞和精子的形态观察一、实验目的：掌握胚胎体外操作工具的制备、小鼠超数排卵方法以及小鼠精子和不同发育阶段观卵母细胞的收集方法，观察精子结构和运动状态，评估精子活力，观察卵母细胞结构，了解体外授精操作过程。
二、操作过程：1 胚胎体外操作工具制备在酒精喷灯上将玻璃管拉成直径1mm的细管，连上乳胶管即可。
2 小鼠的抓去与保定3 收集精子断颈处死公鼠，打开腹腔，找到睾丸和附睾，剪取附睾尾，剪碎，置1.5ml离心管底部，加0.5ml 生理盐水，置37度水浴锅20分钟，用吸管从离心管上部取50微升液体，置细胞计数板，观察精子结构、密度和活力。
精子活力计算公式：精子活力＝视野中直线运动的精子数/视野中总精子数4 收集卵母细胞成熟卵母细胞的收集：母鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG（每只10单位），48小时后再注射人类绒毛膜促性腺HCG（每只10单位），18小时后断颈处死母鼠，打开腹腔，剪下输卵管，用镊子刺破输卵管壶腹部，释放卵母细胞，用透明质酸酶溶液（10毫克/毫升生理盐水）处理卵母细胞以除去颗粒细胞，在实体显微镜下观察卵母细胞的结构。
未成熟卵母细胞的收集：断颈处死性成熟前母鼠，打开腹腔，剪取卵巢，加入1毫升盐水，用刀片或镊子捣碎卵巢，寻找生发泡状态的卵母细胞，观察卵母细胞结构。
5 体外授精将卵母细胞与精子共培养（微滴培养法）（演示）三、实验结果各种精子和卵子的形态绘图；精子活力；精子密度四、实验收获与体会，存在问题和改进意见。
实验二：小鼠早期不同发育阶段胚胎的收集、观察以及胚胎移植一、实验目的：掌握小鼠附植前胚胎收集方法，观察不同发育阶段小鼠胚胎的结构，认识小鼠早期胚胎形态学，并了解体内发育阶段与所处生殖器官位置的关系，了解小鼠胚胎移植的基本原理和操作过程。
二、操作过程：1 小鼠超数排卵程序中午12时腹腔注射PMSG，48小时后腹腔注射HCG并与公鼠合笼交配，次日清晨检查阴道栓，如果发现阴道栓则妊娠0.5天。
小鼠早期胚胎发育和胚胎移植
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小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。
胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。
胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。
小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。
胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。
胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。
一些发达国家已有经营奶牛和肉牛胚胎移植的企业公司，向国外销售胚胎。
在我国，这一技术的研究起步较晚，1974年在绵羊上获得成功，1978年在奶牛上获得成功，80年代后期90年代初，奶牛、安哥拉山羊和绵羊的胚胎移植开始在生产上应用。
胚胎移植术也是显微操作中最基本的实验技术，是从事其它显微操作如嵌合体动物、胚胎干细胞、转基因动物和细胞核移植等实验必不可少的步骤。
下面以小鼠为例，介
绍哺乳动物的早期胚胎发育及胚胎移植的操作过程。
实验技术
一、人工催情和超数排卵
1. 小鼠的性别鉴定：
成年小鼠的性别较易鉴别。
雌鼠可见有明显的阴道开口和明显的五对乳头，雄鼠可见明显的阴囊，仔鼠或幼鼠则主要以它们的外生殖器与肛门的距离来区别，距离近的为雌鼠，距离远的为雄鼠。
2. 人工催情：
成年小鼠在非妊娠和非哺乳期间，任何时间都可发情，性周期为4-5天。
超数排卵一般选用体重在20-30g的雌鼠，注射孕马血清（PMSG）促使超排。
每头雌鼠注射PMSG 5-10IU，注射时间可在第一天下午4时左右，注射部位为腹腔。
在第三天的下午4时左右腹腔再注射绒毛膜促性腺激素（hCG）5IU，并和雄鼠合笼饲养让其自然交配。
第四天上午8时左右检查雌鼠，如有阴道栓形成者，即可供采卵。
阴道栓是雌鼠交配后精液与阴道分泌物及阴道上皮等凝结而成的，位于阴道口附近，一般在交配后数分钟即可出现
（图16.3）。
最初阴栓湿润而软，随后逐渐变硬转为黄色，最后阴栓缩入阴道液化而消失，此过程需10余小时，有的在24-48小时后仍可见。
在合笼后每天上午8-9 时，下午5-6时检查阴栓，出现阴栓即可认为是妊娠的第一天，即胚龄的第一天。
二、受精卵及囊胚的获得
1. 受精卵的获得：
将检查有阴栓的小鼠用脊椎脱臼法处死，70%酒精消毒腹部。
在腹部中央横剪一小口（0.5cm 宽），将两边皮肤肌肉沿切口部剪开，暴露腹部器官；用剪刀和镊子除去卵巢、输卵管和子宫周围的脂肪组织，把输卵管取出（图16.4，16.5），置于盛有培养液的表面皿中。
在解剖镜下找到输卵管膨胀的壶腹部，用镊子撕开一小口，卵子即自然流出（图16.6）。
如受精卵已迁移到输卵管的狭窄部，则可用冲洗法收集受精卵。
方法是：在解剖镜下找到输卵管喇叭口，可以用小玻璃探针帮助，将吸有冲卵液的注射器针头对准喇叭口，右手用小镊子轻轻将喇叭口套在针头上，套进约1mm即可，并用镊子把管
口轻轻夹住；左手轻推注射器，压出0.5ml冲卵液即可将输卵管中的卵冲出。
一般在一侧输卵管中可冲出4-10个卵。
收集到的受精卵带有卵丘细胞，必须在含有透明质酸酶（Hyaluronidase,1mg/ml）的培养液中溶去卵丘细胞，再将受精卵换到新鲜的培养液内洗涤3-4次才可用于移植。
冲卵液要保持37℃。
2. 囊胚的获得：
取妊娠第四天的供胚鼠，同法取出子宫，放在消毒滤纸上，吸净子宫周围的血液。
用装有冲卵液的注射器针头从上端（即靠近卵巢一端）插入子宫，将胚胎冲入培养皿中。
用移卵吸管吸取胚胎放入新的培养液中清洗一下，用于移植。
三、假孕鼠的制作
1. 不育雄鼠：
选性成熟且健壮的雄鼠，结扎输精管，恢复2-3周后，与性成熟的雌鼠交配，检查雌鼠有阴道栓但不怀孕产仔。
证明结扎手术成功，可作为不育雄鼠或称阉割鼠。
2. 供胚鼠：
选择性成熟且处于发情期的雌鼠，在下午4时左右与雄鼠合笼，第二天早晨挑出有阴道栓者为供胚鼠或称孕鼠。
3. 假孕鼠：
假孕鼠是胚胎移植时的受体。
其生殖系统生理状态与移入卵的发育阶段同步，从而为移植的胚胎提供着床和继续发育的条件。
一般选择生过一胎，母性较好的雌鼠和阉割鼠合笼，次日上午挑选有阴道栓者为假孕鼠。
四、胚胎移植
从受精卵到囊胚（受精0.5-3.5天），都可以转移至假孕鼠的生殖管道以完成发育。
胚胎移植有输卵管移植和子宫移植两种。
单细胞到桑椹期的卵可转移至受孕0.5天的假孕鼠的输卵管。
输卵管移植仅适用于被透明带包裹的卵；3.5天的囊胚转移至假孕鼠的子宫。
用于子宫移植的胚胎不需有透明带。
1. 输卵管移植（图16.7）：
（1）将假孕鼠麻醉后在背部偏下方表皮，70%酒精消毒。
（2）在背腰中央纵向剪开皮肤，开口约为0.7cm。
用镊子沿切口剥开皮肤、肌肉，透过肌层可见白色脂肪垫位于脊柱两侧约1cm处。
（3）在脂肪垫的位置剪开肌肉层，切开0.5cm的小口，用小镊子夹住脂肪组织，把一侧的卵巢、输卵管与子宫一起拉出，固定好，置于显微镜下。
（4）用移胚管吸取卵子。
可先吸入部分石蜡油，再吸卵以便于控制。
吸卵前先吸1个气泡，然后再吸一段培养液，接着吸卵，再吸一个气泡，最后吸进一些培养液。
（5）用镊子夹住输卵管喇叭口周围接合部，随即将移胚管插入喇叭口中，轻轻向输卵管内吹气，直至第二、第三个气泡进入输卵管内。
移胚管略停一下再行拔出，以防气泡与卵子逸出。
（6）将脂肪垫、卵巢、输卵管及子宫等复位，缝合伤口。
小鼠苏醒后单笼饲养，18天左右分娩。
2. 子宫移植（图16.8）：
（1）小鼠的麻醉和解剖同输卵管移植。
（2）解剖镜下用小镊子夹住子宫上端，在子宫上端血管分布少处，用4号针头刺破子宫壁。
拔出针头。
（3）用移胚管吸取囊胚，方法同输卵管移植，将移胚管沿原针刺孔隙插入子宫，轻轻将胚胎吹入子宫内。
（4）将子宫、输卵管及卵巢等复位。
缝合伤口，消毒后等待小鼠苏醒。
18天左右分娩。
实验观察
小鼠着床前的胚胎，直径约为90-100微米（包括透明带）。
在解剖镜（25×）下，只能看到它的存在，对细胞形态无法辨认。
在进行活体观察时，最好用150×或300×的相差显微镜，在视野内可以清楚地看到受精卵和周围的透明带，透明带内有1-2个极体，位于受精卵的一侧。
哺乳动物的卵裂是不同步的，2细胞期分裂球近圆形，大小不完全相等，在两分裂球之间有一极体，透明带清晰可见。
4细胞期与其他脊椎动物的分裂情况不同，可以看到四个分裂球交错排列。
8细胞期，仍可看到极体和透明带。
分裂球排列分成上下两层。
分裂球均呈圆形。
16细胞期为桑椹胚。
32细胞期，在分裂球之间出现缝隙，系囊胚腔的开始。
72小时后出现完整的囊胚腔，腔的一侧，集中有一群细胞，此即内细胞团。
围绕囊胚腔四周的单层扁平细胞，称为滋胚层。
此时的囊胚也称胚泡。
晚期胚泡的透明带逐渐膨胀分解，在着床前去除透明带的胚泡呈椭圆形
为了观察不同发育时期的胚胎，可以根据小鼠胚胎发育时间表（见附表），定时从孕鼠的输卵管或子宫内将胚胎取出进行观察（图16.9）。
实验材料
1.实验材料：
性成熟雌、雄昆明小白鼠
2.实验仪器：
解剖镜、显微镜、相差显微镜、注射器（1ml）、4号针头（磨平、末端磨细）、玻璃探针、微吸管（内径0.2mm）、表面皿、培养皿、双孔凹面玻片、外科手术器械。
3.实验药品：
孕马血清促性腺激素（PMSG）
绒毛膜促性腺激素（hCG）
冲卵液（杜氏磷酸缓冲液，pH7.2-7.4）：
NaCl 8.00g
KCl 0.20g
NaHPO4 1.15g
CaCl2 0.132g
KH2PO4 0.2g
MgCl2 0.1g
将上述药品称好后，放入试剂瓶内，再加重蒸水至1000ml，摇匀，用NaOH和HCl（0.1ml/1L）调pH到7.2-7.4即可使用，也可放入4℃冰箱中保存备用。
Whitten氏培养液：
NaCl 5.14g
KCl 0.356g
KH2PO4 0.162g
MgSO4.7H2O 0.294g
NaHCO3 1.9g
葡萄糖1.0g
乳酸钠（60%）3.7ml
乳酸钙0.527g
丙酮酸钠0.025g
青霉素0.075g
链霉素0.050g
1%酚红1ml
小牛血清白蛋白3.0g
双蒸水1000ml
麻醉剂（乙醚）、石蜡油、外科消毒药品、沙布、药棉等。
