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苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达

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第37卷　第1期2009年1月西北农林科技大学学报(自然科学版)JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat.Sci.Ed.)Vol.37No.1Jan.2009

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22的克隆与表达3

伍金元a,冯纪年a,张　兴b(西北农林科技大学a.植保资源与病虫害防治教育部重点实验室,b.无公害农药研究服务中心,陕西杨凌712100)[摘　要]　【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,

从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL2c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS2PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutellaxylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。[关键词]　苏云金芽胞杆菌;杀虫晶体蛋白基因cry1Ab22;生物杀虫活性[中图分类号]　S482.3+98[文献标识码]　A[文章编号]　167129387(2009)0120151204

CloningandexpressionofICPcry1Ab22geneofBacillusthuringiensWUJin2yuana,FENGJi2niana,ZHANGXingb(aKeyLaboratoryofPlantProtectionResourcesandPestManagement,MinistryofEducation,

bResearchandDevelopmentCenterofBiorationalPesticide,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】CloningandexpressionofICPcry1Ab22geneofBacillusthuringiensnotonlygiveawaytoresolveinsectresistance,butalsoprovidethegeneticmaterialforconstructingthenewtrans2genicprojectfungusandtransgenicplant.【Method】Accordingtocry1Abgenesequencesof5′2terminaland3′2terminal,apairofprimersforfull2lengthcry1AbgeneontheGenBankwasdesigned.Thecry1AbtypegenewasclonedintotheE.coliexpressionvectorpMAL2c2X,whichwasthentransformedintoE.coli

TB1,inductionexpressionforBacillusthuringiensanddetectedtheactivityforexpressionproduct.【Re2sult】PCRwasperformedtoproduceacry1Abtypegenewhichwasdesignatedcry1Ab22inGenBank(Ac2cessionNo.EU220269).Thelengthofgenewasabout3.5kb,andthecomparisonshowedthehighestho2mologywiththecry1Ab3and5aminoaciddifferencesexistedinEncodedproteinofcry1Ab22.The170kufusionproteincouldbeidentifiedobviouslybySDS2PAGE.BioassayshowedthattheLC50ofcry1Ab22a2gainstPlutellaxylostellalarvewithaspreadmethodwas225.1μg/mL.【Conclusion】Thereisanovelcry1AbtypeinstrainS249andcry1Ab22proteinhasastrongerbiologicalinsecticidalactivity.Keywords:Bacillusthuringiensis;Insecticidalcrystalproteinscry1Ab22gene;Biologicalactivity

3[收稿日期]　2007212212

[基金项目]　国家“十五”科技攻关项目(2002BA516A04);西北农林科技大学研究生教育创新计划项目(05YCH007)[作者简介]　伍金元(1982-),男,四川富顺人,在读硕士,主要从事苏云金芽孢杆菌分子生物学研究。E2mail:wade@nwsuaf.edu.cn[通信作者]　冯纪年(1957-),男,陕西白水人,教授,博士生导师,主要从事昆虫分类及分子生物学研究。 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是昆虫病原细菌,革兰氏染色呈阳性,其在形成芽孢的同时产生伴孢晶体[1]。伴孢晶体由一种或几种蛋白组成,具有高度特异的杀虫活性,这种蛋白通常被称为δ2内毒素(δ2endotoxins)或杀虫晶体蛋白(Insec2ticidalcrystalproteins,ICPs)[2]。根据Neil2Crick2more分类法,到目前为止,ICPs基因有55群,98类,167种,407亚种[3],其中cry1Ab基因共有22个亚种[4]。近年来,虽然在苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白基因工程研究领域取得了很大的成就,而且Bt杀虫剂作为公认的无公害农药,己在许多国家和地区推广使用,但是仍然存在着一定的局限性,主要表现为:杀虫谱窄、毒力不够强、易诱导昆虫产生抗性,从而限制和影响了Bt杀虫剂的进一步推广应用。因此寻找新的具有杀虫活性的基因,可以在一定程度上提高昆虫对毒蛋白的敏感性,延缓昆虫抗性的产生。本研究根据cry1Ab类基因序列设计特异引物,加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点,应用PCR方法对苏云金芽孢杆菌S249cry1Ab22基因进行了扩增,并将其在大肠杆菌TB1中表达,对表达的cry1Ab22蛋白的生物活性进行了检测,以期寻找到新的杀虫蛋白。1　材料与方法1.1　供试菌株、质粒及生化试剂1.1.1　供试菌株和质粒　苏云金芽孢杆菌S249和转化受体菌E.coli.DH5α,均由西北农林科技大学植保资源与病虫害防治教育部重点实验室保存;E.coli.TB1和pMAL2c2X,均由西北大学惠有为教授惠赠。1.1.2　试　剂　限制性内切酶PstⅠ购自EnglandBioLab公司,BamHⅠ购自Fermentas公司;T4DNA连接酶购自Invitrogen公司;pGEM2TEasy载体试剂盒和PCR试剂盒均购自Promega公司;AgaroseGelDNAPurificationKit试剂盒购自TaKaRa公司。其他试剂均为分析纯或电泳纯级。1.2　Btcry1Ab22基因的PCR扩增与序列分析1.2.1　基因的提取及cry基因的鉴定　苏云金芽孢杆菌质粒DNA的提取参照钟万芳等[5]的方法进行。cry基因的鉴定参照宋福平等[6]的方法进行。1.2.2　引物的设计与合成　参考已知cry1Ab型基因序列[7],设计1对引物:Sense:5′2CGCGGATCCATGGATAACAATCCGA23′;Anti2sense:5′2AAAACTGCAGTTATTCCTCCATAAGGAG23′。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,

Sense和Anti2sense的下划线部分分别为BamHⅠ与PstⅠ酶切位点。1.2.3　Btcry1Ab22基因的PCR扩增　以苏云金芽孢杆菌S249质粒DNA为模版,采用高保真的ExTaq

TM聚合酶进行扩增,具体方法参照PCR试

剂盒说明书进行。PCR反应条件:94℃3min;94

℃10s,50℃30s,68℃2.5min,10个循环;94℃10s,50℃30s,68℃2.5min,20个循环,每个循环延伸时间递增10s;68℃8min。参照TaKaRa

公司的AgaroseGelDNAPurificationKit试剂盒说明,对扩增产物进行纯化回收。1.2.4　PCR产物的克隆与鉴定　目的片段的克隆按pGEM2TEasy载体试剂盒的操作说明进行。将回收的PCR产物和pGEM2TEasy克隆载体于4℃连接过夜,构建pGEM2TEasy2cry1Ab22质粒,转化大肠杆菌DH5α,用含IPTG、X2Gal和氨苄青霉素的LB平板筛选克隆子。提取筛选得到的克隆子质粒,进行PCR和BamHⅠ、PstⅠ双酶切鉴定,证明所得重组子含有所需的克隆片段,阳性重组质粒命名为pG1a。试验中质粒的提取、感受态细胞的制备及转化按《分子克隆实验指南》的方法进行操作[8]。将阳性克隆子送上海生工生物工程技术有限公司测序。对测序结果应用ExPASy(http://au.

expasy.org/)推断其氨基酸序列、计算预测

cry1Ab22蛋白的分子质量和等电点的理论值;采用BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进

行同源性比较分析。1.3　Btcry1Ab22基因表达载体的构建与鉴定将pG1a质粒和pMAL2c2X质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ、PstⅠ双酶切,琼脂糖凝胶回收线性cry1Ab22和pMAL2c2X片段,于16℃用T

4

DNA连接酶连接10h,用热休克法将连接产物转化

DH5α,挑取单菌落,进行PCR扩增鉴定。最后提取PCR鉴定阳性克隆的质粒,进行BamHⅠ和PstⅠ双酶切鉴定后,送上海生工公司进行正、反向序列测定,以确定读码框的正确性。重组质粒命名为pM1a。1.4　Btcry1Ab22基因的表达将重组质粒pM1a转化大肠杆菌TB1。将含cry1Ab22基因的重组大肠杆菌TB1接种于LB培养基(含100mg/LAmp)中,于37℃、200r/min振

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转基因抗虫棉花基因类型及原理研究进展

转基因抗虫棉花基因类型及原理研究进展

转基因抗虫棉花基因类型及原理研究进展孙璇;马燕斌;张树伟;段超;王新胜;李燕娥【摘要】评述了苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因、苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、植物外源凝集素类基因、RNA干扰技术涉及到的一些昆虫来源基因等几类抗虫基因的抗虫机理及其在转基因棉花中的应用,并分析了抗虫转基因棉花研究目前存在的问题和发展趋势.通过回顾总结我国转基因抗虫棉已取得的成果,以了解我国现阶段转基因抗虫棉研究的进展程度,为进一步研究转基因抗虫棉提供方向.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2016(044)001【总页数】4页(P115-118)【关键词】棉花;转基因;抗虫基因【作者】孙璇;马燕斌;张树伟;段超;王新胜;李燕娥【作者单位】山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000【正文语种】中文【中图分类】S562棉花（Gossypium hirsutum L.）隶属于锦葵科（Malvaceae）棉属（Gossypium），是世界上最主要的经济作物之一，同时，其也是我国重要的经济作物之一。

随着基因工程技术的快速发展，转基因抗虫棉得到了迅猛的发展。

转基因抗虫棉基因类型主要有：苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）基因；苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白（Vegetative Insectidal Proteins，VIPs）基因；蛋白酶抑制剂（Proteinase Inhibitors，PIS）基因；植物外源凝集素（Lectins）类基因以及RNA干扰技术（RNAi）所涉及到的一些昆虫来源基因等。

探讨二化螟基因组及功能基因与分子生物学领域的研究-分子生物学论文-生物学论文

探讨二化螟基因组及功能基因与分子生物学领域的研究-分子生物学论文-生物学论文

探讨二化螟基因组及功能基因与分子生物学领域的研究-分子生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：简要介绍近年来二化螟生理生化与分子生物学领域的研究进展, 综述二化螟基因组及功能基因、抗药性、对Bt抗性的分子机制、神经受体、嗅觉相关基因、miRNA、热休克蛋白, 以及被寄生蜂调控等相关研究, 旨在为二化螟的绿色防控提供理论参考。

二化螟(Chilo suppressalis) 在亚洲、北非和南欧是最重要的水稻害虫之一。

二化螟幼虫在水稻叶鞘和茎秆内钻蛀为害, 形成枯心、白穗及虫伤株等[1]。

在中国, 二化螟每年都能造成严重的生产损失, 化学防治目前依然是主要的防治手段, 但是二化螟已对多种农药产生抗性[2]。

二化螟基因组测序、转录组测序和小RNA测序的不断完成, 为研究二化螟生理生化特性和基因功能提供了坚实的基础。

CRISPR/Cas9技术在二化螟中已得到成功应用[3], 将为今后二化螟基因功能的解析、开辟二化螟新型防控技术提供坚实的技术支撑。

为此,本文就近年来有关二化螟基因组及功能基因、抗药性、对Bt抗性的分子机制、神经受体、嗅觉相关基因、热休克蛋白, 以及被寄生蜂调控等相关研究的最新进展进行概述。

1 二化螟基因组及功能基因随着组学及相关技术的迅速发展, 二化螟基因组及功能基因组研究也得以发展。

在完成二化螟基因组测序的基础上, 二化螟基因组数据库ChiloDB已构建。

该数据库收录了二化螟的基因组、转录组和小RNA数据, 为二化螟研究提供了开放的数据平台[4,5]。

另外, 二化螟的中肠、脂肪体、血细胞、触角、信息素分泌腺和神经系统等不同组织的转录组测序[6,7,8,9,10,11]也为二化螟功能基因研究提供了基础。

基于基因组和转录组数据, 二化螟的类胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[12]、类丝氨酸蛋白抑制剂[13]、类半胱氨酸蛋白酶[14]、P450[15]和几丁质酶[16,17]等基因家族被鉴定分析, 这些研究为深入解析各家族基因的功能奠定了很好的大数据基础。

BT基因

BT基因

BT基因BT基因即是苏云金芽胞杆菌基因。

苏云金芽胞杆菌可以分泌一种毒蛋白，对鳞翅目鞘翅目昆虫（比如小菜蛾）有很强的杀伤作用。

人类很早就研究利用BT菌来杀灭害虫，总共有100多年历史。

随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术出现，人类开始从BT 菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，制作生物农药。

不过现在随着广泛的应用，害虫也大量出现抗药性。

目录1 概述2 Bt的生活史3 Bt的毒素4 杀虫机理5 实际应用1 概述苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。

Bt与其它芽胞杆菌相比，一个显著特点就是不仅能够形成芽胞，同时还能产生由杀虫蛋白组成的晶体。

苏云金芽脑杆菌属于芽胞杆菌属的一个种。

根据鞭毛抗原的血清型和生理生化特性可以划分为若干亚种；由于无鞭毛亚种的出现，营养细胞的酯酶型可以作为补助分类方法。

2 Bt的生活史在外界条件适宜时，Bt的营养体进行横裂生殖；当营养体老熟或者外界条件苛刻时，将进入产胞循环。

包裹在芽胞与晶体外侧的细菌壁在后期破裂，释放出自由的芽胞和伴胞晶体；当外界条件适宜时，芽胞萌发为营养体进而开始新的生命循环。

Bt的形态营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.2～1.8×3.0～5.0 μm；周生鞭毛，微动或不动；单个或两个以上呈链状存在。

芽胞和伴胞晶体：芽胞约0.8～0.9×2.0 μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。

伴胞晶体的形状因菌株的不同而有所差别。

3 Bt的毒素Bt的毒素主要为内毒素和外毒素。

外毒素指细菌在生命活动过程中排出体外的代谢物，包括α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、不稳定外毒素和水溶性外毒素等。

内毒素又称δ-内毒素、晶体毒素或杀虫晶体蛋白3伴胞晶体由一种或几种杀虫晶体蛋白组成，在Bt对昆虫的致死过程中起主要作用。

杀虫晶体蛋白是根据氨基酸同源性进行分类的。

克隆基因的表达

克隆基因的表达


柱（column） GST
洗脱 柱（column） 可再利用 GST
外源蛋白
pGEX
（5）其他融合蛋白系统
His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸 （His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被 EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以 纯化蛋白质。
人胰岛素 在大肠杆 菌中的表 达
二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA。 3. 不能直接用真核基因组DNA。
4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）。 5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。
N:抗终止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）； cI, cII, cIII: 阻遏蛋白； P:启动子；O:操纵基因。 R:右；L:左
早期左边
转录
转录
cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII
阻遏物
转录
早期右边
当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合 酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使 cI进一步转录。进入溶原期。
用温度或化学试剂诱导。
（2） 乳糖启动子lac 来自大肠杆菌的 乳糖操纵子。 用乳糖或其类似 物IPTG充当诱导 物，与阻遏蛋白 结合，解除抑制。 Plac O 目的基因
阻遏物与操纵基因结合
DNA结合 位点
诱导物结 合位点
四聚体的 阻遏物
阻遏物与DNA的结合
①乳糖操纵子控制区的结构
“可移动的lac启动子小片断” 组成： 阻遏物作用区 CAP作用区 RNA聚合酶作用区 长度：