实验一 苏云金芽孢杆菌ICP基因的检测PPT教学课件

ＡＢＳＴＲＡＣＴＩｎｓｅｃｔｓｗｏｕｌｄｄｅｖｅｌｏｐｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅＢ口ｃｆ盯淞历“ｒｆ愕ｆＰ珊括ｔｏｘｉｎｓ，ａＩｌｄｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｐＨｏｆｉｔｓｍｉｄｇｕｔｊｕｉｃｅｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｕｎｋｎｏｗｎ．ＡｍｏｄｉｆｉｅｄＳＤＳ—ａｌｋａｌｉｎｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆＢｔ４．０７１８ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＰ３ｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｔａｉｎｃ，），１Ａａｇｅｎｅ．Ｂｙａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓｒｅｇｉｏｎｏｆ１３ｋｉｎｄｓｏｆｃＷｌＡａｇｅｎｅｗｉｔｈｍｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｂｎｎａｔｉｏｎ’ｓＢＬＡＳＴＷＷＷｓｅｒｖｅｒ’ｐｒｉｍｅｒｓＨ０１ａｎｄＨ０２ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏａｍｐｌｉ６ｅｄｆＷｌＡａｇｅｎｅｆｒｏｍＰ３ｐｌａｓｍｉｄ，ｔｈｅｎｔｈｅＰＣＲＤｍｄｕｃｔｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＡａｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ３．５一ｋｂＢ日历ＨＩａｎｄＳ口ｆＩｉｎｓｅｒｔｏｆｐＭＤｌ８一ＴｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏⅡｎｅｄＥ∞，ｆｓｔｒａｉｎＢＬ２ｌ（ＤＥ３）ｔｏｇｉＶｉｎｇＥＴＡａｓｔｒａｉｎ，ａｎｄａ１４１－ｋＤｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｂｙｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧＳｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｍｅｄｉｎａｔ、Ｖｏ－ｓｔ印ＰＣＲｗｉｔｈｔｈｒｅｅｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｍｅｆｉｒｓｔｓｔｅｐｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔｈｅ“ｂｉｇｐｒｉｍｅｒ＂ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄＰＣＲｔｏａｒｎｐｌｉｆｉｅｄｔｈｅｌ０４８－ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｅｄ．Ａ２２４－ｂｐｍｕｔａｔｅｄｆ｝ａｇｍｅｎｔｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉｇｅＳｔｉｎｇｐＭＤＭＸｗｉｔｈ砌ＰＩａｎｄ丑ｆｓＨＩＩａｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｍｅｆｈｇｍｅｎｔｉｎｐＭＤＡａａｔｔｈｅｓａｒｎｅｐｏｓｉｔｉｏｎｔｏｇｅｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＭＤＭａ．ｐＭＤＭａｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＢ日ｍＨＩａｎｄＳｂ，Ｉ，ｔｈｅ３．５－ｋｂｍｕｔａｔｅｄ矗ａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａＶｅｃｔｏｒｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｍｕｔａｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎＥＴＭａＣ８１２ＡａｎｄＣ８１４Ａ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｔａｍｃ，），１ＡａｇｅｎｅｗａｓａｌｓｏｏＶｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ舶ｍＥＴＡａｓｔｒａｊｎａ１１ｄｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｄｉｓｓｏｌＶｅｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ２一Ｍ［ｅｒｃａｐｔｏｅｍａｎｏｌｓ锄ｅｐＨｏｒｉｎｄｉＶｉｄｕａｌｌｙ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔ１１ａｔ，ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２－Ｍｅｒｃａｍｏｅｔｈａｎｏｌ，ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ疔ｏｍｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｍｏｒｅｅａｓｙｔｏｄｉｓｓｏｌｖｅ，ａｎｄｃｏｕｌｄｄｉｓｓｏｌｖｅｂｅｔｔｅｒｉｎ１０ｗｐＨｏｒｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２一ＭｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌｔｈａＪｌｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓｆ＿ｒｏｍＥＴＡａｓｔｒａｉｎ．ＩｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｎｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＣ８ｌ２ＡａｎｄＣ８１４Ａｃｏｕｌｄｓｉｇｎａｌｌｙｃｈａｎｇｅｔｈｅｄｉｓｓｏｌｖａｂｉｌｉｔｙｏｆｊｎｃｌｕｓｊｏｎｂｏｄｉｅｓ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｐｒＤＶｉｄｅａＶａｌｕａｂｌｅｏｐｔｉｏｎｆｌｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄｏｎｓｕｃｈａｂａｓｅ，出ｅｒｏｌｅｏｆｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｉｎｔｈｅｐｒｏｔｏｘｉｎｓｔａｂｉＩｉｔｙａ１１ｄｔｏｘｉｃｉｔｙｃａｎｂｅｍｒ出ｅｒａｃｈｉｅｖｅｄＫｌｅｙｗｏｒｄｓ：８口ｃ“，￡岱ｆ是“ｒ豫ｉｌ拿挖ｓ扭，ｃ，ｙｌＡａｇｅｎｅ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ前言１．苏云金芽孢杆菌１．１苏云金芽孢杆菌（Ｂｔ）概论苏云金芽孢杆菌（肋ｃｆ，，“ｓ胁“ｒｆ娼招瑚如，简称Ｂｔ）是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌，按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版可将其归属为第二类第十八群芽孢杆菌属（口口ｃ讲珊）中的一种【ｌＪ。

※生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11147产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产 抗菌物质性质李 云，杨胜远 * ，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 摘 521041)要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株 K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。

发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白 酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。

通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育 分析，鉴定菌株 K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

菌株 K2 产生的抗菌物质在 pH6～9 条件下 80℃处理 30min 仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。

该抗菌物质 在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。

关键词：苏 云 金 芽 孢 杆 菌；细菌素；鉴定；抗 菌 物 质Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial SubstancesLI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia (Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)Abstract： Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis. The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6 － 9 for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from midlogarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase. Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance 中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机 制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制 其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有 免疫性[ 1 ] 。

含cry8 型基因苏云金芽孢杆菌的分离和鉴定王志鑫1，束长龙2，申培立1，苏旭东1，李志辉1，于妍1，张先舟1，马雯1，檀建新1【摘要】摘要:为发掘对蛴螬有防治作用的苏云金芽孢杆菌及其cry 基因，在河北省各县市共采集土壤样品254 份，采用温度筛选法分离出Bt 菌株42 株，经PCR-RFLP 方法鉴定，其中10 株含有cry8 型基因。

这些菌株有如下特点:同一菌株含1 种或多种质粒;PCR-RFLP 鉴定证明有多种cry8 基因存在，多数菌株中含2 种cry8 基因，如cry8E 和cry8F 常共存于同一菌株中;Cry8 杀虫晶体蛋白分子量约为130 ～140 kDa，晶体形态均为球形。

这10 株菌采样地点分布于保定、衡水、邯郸、廊坊、唐山和邢台等地，植被类型多样化，说明cry8 型Bt 菌株在河北省分布广泛，可为蛴螬类害虫的防治提供丰富的Bt 资源。

【期刊名称】华北农学报【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6【关键词】关键词:苏云金芽孢杆菌;基因鉴定;cry8 基因;PCR-RFLP;蛴螬苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种在土壤中广泛存在的革兰氏阳性菌，在其营养期后期产生的伴孢晶体(也称为杀虫晶体蛋白)对多种昆虫具有高效且专一的杀虫效果，其杀虫谱包括鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、同翅目(Homoptera)等10 个目500 多种害虫［1-2］，尚未发现对人、畜、昆虫天敌及水生生物有危害，因此，作为一种微生物杀虫剂被广泛应用于农林业等害虫的生物防治。

蛴螬是金龟子总科幼虫的统称，可以危害多种农作物，如花生、大豆、玉米、马铃薯等，给农业生产造成巨大损失，据调查统计，86%的植物地下部分损伤由蛴螬引起［3］，在我国蛴螬的发生面积约为每年666.7 万hm2，严重时达2 133.3 万hm2，作物产量损失可达20%～40%［4］;还对城市绿化，足球场和高尔夫球场的草坪维护带来很大影响［5］。

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的制备王子佳;李红梅;弓爱君;李圆原;邱丽娜【摘要】采用液体培养和固体培养两种不同的方法培养苏云金芽孢杆菌,并比较了高速离心法、透析法以及等电点沉淀法三种纯化方式对伴孢晶体的纯化效果.镜检观察结果表明,固体培养更有利于菌体产生伴孢晶体.利用棉铃虫进行的生物测定结果表明,透析法纯化所得伴孢晶体生物效价较高,达到150 000 IU·mg-1.扫描电镜观察结果显示,透析法纯化所得伴孢晶体纯度较高且形态完整.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2009(026)009【总页数】3页(P56-58)【关键词】苏云金芽孢杆菌;伴孢晶体;高速离心;透析;等电点【作者】王子佳;李红梅;弓爱君;李圆原;邱丽娜【作者单位】北京科技大学,北京,100083;中国计量科学研究院,北京,100013;北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083;北京科技大学,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】TQ458苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal protein，ICP)，对敏感昆虫有特异性的防治作用 [1]。

作为世界上开发最成功的微生物杀虫剂[2]，大部分苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因都编码δ-内毒素蛋白[3]。

一般认为，δ-内毒素的作用过程要经过溶解、酶解活化、与受体结合、插入孔洞及离子通道形成5个环节。

对不同昆虫有特异毒性的伴孢晶体(Parasporal crystal)被昆虫吞食后，在昆虫中肠特殊pH值条件下被溶解释放出ICP。

然后,在中肠拟胰蛋白酶的作用下，通过剪切被激活成为抗蛋白酶的毒素核心片段(Toxin core fragment)。

激活的ICP特异地与中肠上皮细胞受体结合，破坏细胞通透性，最后导致膜穿孔,使昆虫因整个细胞代谢失去平衡而死亡。