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到２００５年使生物农药使用量占到农药总量的３０％，２０１５年占到５０％。
目前，我国农药耗用量每年达１５０万吨以上，按此比例计算，２００５年需生物农药４５万吨，２０１５年达７５万吨。
而目前我国生物农药仅８０００吨，在农药总量中不到１％。
由此可见，生物农药具有很好的发展前景。
苏云金杆菌作为应用最广泛的生物农药，其发展潜力是可以预测的。
２苏云金杆菌的产生背景及发展１９叭年，德国南部一个叫苏云金的小城镇上，一家面粉加工厂发生了一件怪事，一种叫地中海粉螟的仓库害虫，平时粉蛾飞舞，幼虫在面粉中爬来爬去，这一天，有人发现那些小爬虫突然卷曲死ｌ二。
这件事弓ｆ起了生物学家贝尔内里的注意，经过无数次努力，贝尔内里从虫ｔｒ＿｜中分离出来这利，杆状细菌。
４年以后．克林诺发现．在细菌的芽孢形成不久，还会形成一些正方形或菱形的晶体，可惜这个发现来被重视。
１９５３年，汉纳证明了这种晶体是有赤的噩白晶体，粉螟幼虫自然死【＝＝的原因不吉臼明了。
这种细菌以发现的地方命名，叫嚣云金杆菌。
经过几十年的势力。
科学家们用实验证明苏云金杆菌可以防治鳞翅曰、膜翅日、直翅目、鞘翅目等１３０多种害虫。
３苏云金杆菌的杀虫机理苏云金杆菌杀虫作用的主要成分是孢子形成过程中产生的伴孢晶体（ＩｃＰｓ），它足单基因表达的产物”。
伴孢晶体经敏感昆虫口服后，在中肠碱性环境中，被降梓为活性的多肽片断（ＩｃＰ的毒性片断包含三个不同的结构域。
一般认为结构Ｉ参与孔道的形成．结构域ＩＩ决定毒素与受体的特异性结合。
结构域ＩＩＩ主要调节毒素的活性）”’，再与巾肠受体蛋白（陷锄）结合，形成细胞膜通道，破坏渗透膜，引起细胞溶解，展终导致虫体死亡。
ＩｃＰ的杀虫作用表现出种属专一性，然而，ＩｃＰ对敏感昆虫的特异性和毒力，除决定于菌株本身外，还决定于昆虫肠液对伴孢晶体的溶解和激活方式，幼虫中肠上皮细胞毒蛋白专一性受体的存在以及昆虫对ＢＴ的抗性“３。
目前，全世界拱分离到５００００株苏云金杆菌，分为６２种血清型和矩种。
晋江二中、鹏峰中学、广海中学、泉港五中2022-2023学年上学期十月高三年联考（答案在最后）生物试卷2022年10月 22 日（满分：100分；考试时间：75分钟）一、单项选择题（第1-12题，每小题2分，第13-16题，每小题4分，共40分。
）1. 下列关于蓝细菌和黑藻的叙述，正确的是（）A. 光合色素的种类和功能均相同B. 核糖体均为合成蛋白质的场所C. DNA复制均需要线粒体提供能量D. 均能在光学显微镜下观察到叶绿体2.《氾胜之书》是西汉晚期农学著作，是中国现存较早的一部农学著作，书中提到收获的粮食要“曝使极燥”，降低粮食的含水量后才入仓储存。
下列说法错误的是（）A.“曝使极燥”后，细胞中自由水含量大幅度减少，细胞的代谢降低B.种子生长发育的不同时期，细胞内自由水与结合水的比值可能不同C.“曝使极燥”使种子细胞的丧失全部结合水，从而抑制种子新陈代谢D.种子萌发形成根系后，吸收的无机盐是溶解于水中形成的离子3. 身体健康才是革命的本钱，生命在于运动，提倡慢跑等有氧运动是维持身体健康和增强体质的有效措施。
下列有关细胞呼吸原理和应用的叙述，正确的是（）A. 在运动过程中，产生的二氧化碳全部来自于有氧呼吸B. 葡萄糖进入线粒体氧化分解放能供肌肉细胞收缩利用C. 剧烈运动产生乳酸释放到血液中，使血浆pH明显下降D. 在慢跑过程中，NADH产生于细胞质基质和线粒体内膜4. 下列有关生物科学史的相关叙述错误的是（）A. 鲁宾和卡门用稳定型同位素标记法发现植物光合作用释放的氧气中的O全部来源于水B. 施莱登和施旺提出的细胞学说的中心内容是所有生物都是由细胞组成C. 罗伯特森在电镜下看到了细胞膜清晰的暗-亮-暗三层结构D. 恩格尔曼用水绵和好氧细菌作为实验材料进行实验证明了氧气是由叶绿体释放出来的5. 下列与中心法则有关的描述，错误的是（）A. 边解旋边复制能提高DNA复制的效率B. 边转录边翻译能提高基因表达的效率C. mRNA结合多个核糖体，能提高翻译效率D. 基因的两条链同时作为模板，能提高转录的效率6. 图1是一个细胞周期内每条染色体上的DNA变化曲线图，图2是根据细胞核DNA含量不同，将大量某种连续增殖的细胞分为三组，统计每组的细胞数而绘制的柱形图。
组织教授参加本科实验课教学的探索张金红刘方白艳玲刁虎欣卜文俊摘要：南开大学调整和完善政策导向，生命科学学院制定相关规定，激励并要求教授必须为本科生讲课，而且要求教授以不同形式参加本科实验教学，既保证了教学工作的中心地位，也进一步提高了教学质量，深受学生的欢迎。
关键词：教授；本科生；实验教学近年来，有些大学教授特别是名教授，把主要精力用于争项目、找经费、作科研，出现无暇顾及本科教学的现象。
学生冲着教授声望入校求学，但在讲台上或实验室中却难以看到教授特别是名教授的身影，引起了“大学教授为什么不给学生教课?不教课算什么教授!”的公众讨论与社会关注。
针对这种情况，南开大学调整和完善政策导向，生命科学学院制定相关规定，激励并要求教授必须为本科生讲课，而且要求教授以不同形式参加本科实验教学，既保证了教学工作的中心地位，也进一步提高了教学质量，深受学生的欢迎。
一、激励并要求教授参加本科实验课教学为保证教学的中心地位，提高教学质量，南开大学在相关文件中，明确规定“教学和科研五个同样对待”，即：要将教学带头人与学术带头人同样对待，教学成果奖与科技成果奖同样对待，教研论文与科研论文同样对待，教研项目与科研项目同样对待，教材与专著同样对待。
根据文件精神，生命科学学院制定了“关于教授为本科生上课的有关规定”。
其中明确规定：1．教授必须给本科生讲基础必修课、专业必修课或专业选修课。
2．教授除为本科生讲授理论课外，还应以不同形式参加本科实验课教学。
3．院长、副院长、系主任、重点实验室主任等主要业务领导以及长江学者特聘教授、新世纪杰出人才、天津市特聘教授、南开大学特聘教授要带头参加本科实验教学。
该规定为教授以不同形式参加本科实验课教学起了保证与推动作用。
二、组织教授以不同形式参加本科实验教学生物实验教学中心除拥有一支长期从事本科实验教学、相对稳定的中青年教授实验队伍外，还组织一批具有较高学术造诣和丰富教学经验的教授以及包括长江学者特聘教授、新世纪杰出人才等在内的名教授，以组织编写实验教材、主持实验教学研究项目、将科研成果转化为实验内容、开设新实验课、指导部分实验内容、指导学生科研创新项目、生物实验新技术新方法系列讲座、实验课责任人等八种不同形式，参加本科实验课教学。
※生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11147产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产 抗菌物质性质李 云，杨胜远 * ，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 摘 521041)要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株 K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。
发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白 酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。
通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育 分析，鉴定菌株 K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
菌株 K2 产生的抗菌物质在 pH6～9 条件下 80℃处理 30min 仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。
该抗菌物质 在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。
关键词：苏 云 金 芽 孢 杆 菌；细菌素；鉴定；抗 菌 物 质Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial SubstancesLI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia (Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)Abstract： Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis. The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6 － 9 for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from midlogarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase. Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance 中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机 制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制 其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有 免疫性[ 1 ] 。
题目苏云金芽孢杆菌的培养林方波20085808（食品科学与工程08-2班）摘要: 本实验采用发酵培养基和肉汤培养基在不同的pH值下对苏云金进行培养，通过蒽酮硫酸法、芽孢染色法、平板计数法分别对苏云金芽孢杆菌的总糖含量、芽孢产率和菌种数来观察苏云金芽孢杆菌培养状况。
实验结果表明苏云金芽孢杆菌在Ph=7（中性）时生长最好、菌种数最多、总糖含量最高，在弱酸性和微碱性环境中生长其次，在酸性条件下生长较差。
Summary：This experiment used fermentation and gravy in different medium under the pH value of some cultivated through anthracene ketone hydrate-sulfuric dyeing method, spores, plate counting method for some respectively the bacillus total sugar content, spores strains of production rate and the number of observation some bacillus cultivation status. Experimental results show that some bacillus in Ph = 7 (neutral) growth is best, in weak acid and micro alkaline environment growth next, in acid conditions poor growth.关键词：苏云金芽孢杆菌pH值培养keyword：Bacillus thuringiensis pH value cultivation前言：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称BT)是一种革兰氏阳性细菌．其特征是在形成芽孢的同时，可以形成一种杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体，这种晶体对多种农业害虫具有杀虫活性．苏云金杆菌目前主要用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫，苏云金杆菌杀虫剂属无公害生物农药，有杀虫效果良好、且对人畜安全、不伤害害虫天敌等特点…，然而目前我国每年生物农药用量仅8000t，在农药总量中不到1％，离生产需要相差甚远．由此可见，生物农药具有很好的发展前景．20世纪80年代以来，世界各国都在研究将苏云金杆菌抗虫特性转移到植物上，让植物直接对抗害虫．我国已通过遗传工程手段将苏云金杆菌抗虫基因成功导入棉花、水稻、烟草上，培育出抗虫棉、抗虫水稻和抗虫烟草；美国、英国、法国、德国、俄罗斯和日本等国都已通过原生质体融合、基因转导等基因操作培育出许多抗虫作物，并已应用于生产中。
苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达摘要:从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670)｡置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物｡关键词:苏云金芽孢杆菌;几丁质酶基因;克隆;序列分析;表达Cloning and Expression of Chitinase Encoding Gene of Bacillus thuringiensis T04A001 StrainAbstract: Chitinase gene chiAC(GenBank Accession Number:EF427670) was cloned by PCR from Bacillus thuringiensis T04A001 genomic DNA. Expression of chiAC under T7 promoter in Escherichia coli could induced by IPTG; and it produced a protein whose molecular weight was about 70 kDa.Key words: Bacillus thuringiensis; chitinase gene; clone; sequence analysis; expression几丁质酶在芽孢杆菌中广泛存在,目前已有多种芽孢杆菌的几丁质酶基因得到了克隆与表达,如环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)､蜡状芽孢杆菌(B. cereus)､苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis,简称Bt)､枯草芽孢杆菌(B. subtilis)以及地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)等[1,2]｡苏云金芽孢杆菌因为对多种害虫具有毒杀作用而一直为人们所关注,目前已有十多个亚种的苏云金芽孢杆菌被证明能产生几丁质酶[3]｡有报道证明,苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶对其杀虫毒力具有增效作用,其杀虫毒力与几丁质酶的活力呈高的正相关(0.75~0.79)[4],表明几丁质酶在外界因素对害虫的侵害中起着重要的作用｡增加外源的几丁质酶可以提高苏云金芽孢杆菌杀虫效果,而用阿洛菌素(一种几丁质酶抑制剂)抑制苏云金芽孢杆菌的几丁质酶后,LC50值增高[5]｡因此,对苏云金芽孢杆菌几丁质酶的性质､编码基因的序列差异性以及几丁质酶基因的表达等方面进行研究,可为几丁质酶更好的应用于生物防治提供依据｡本研究对产几丁质酶活力高的Bt菌株T04A001[6]的几丁质酶基因进行了克隆､测序分析,并将T04A001菌株的几丁质酶基因chiAC的开放阅读框(Open reading frame,ORF)在T7启动子调控下进行原核表达｡几丁质酶基因的序列测定及其在大肠杆菌中的大量表达为研究芽孢杆菌几丁质酶的进化关系､几丁质酶的纯化与制备及更进一步研究提供了条件｡1材料与方法1.1菌株与培养基Bt菌株T04A001为本实验室分离保藏,大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α､BL21为本实验室保存菌株｡LB培养基(每升含10 g蛋白胨,5 g酵母粉,10 g NaCl);氨苄青霉素和卡那霉素使用终浓度分别为50 μg/mL和30 μg/mL,IPTG 使用终浓度为1 mmol/L｡1.2主要试剂与仪器所用内切酶均购自TaKaRa公司;质粒提取､PCR产物回收和DNA片段快速纯化试剂盒购自New England Biolabs公司;His-bind亲和层析蛋白纯化试剂盒购自Novagen公司;其余常规试剂均为Sigma进口分装｡主要仪器有美国Biotecsynergy HT全波长自动酶标仪,美国ABI 9800 PCR仪,电泳系统为美国BioRad DNA电泳系统和蛋白质电泳系统｡1.3DNA的提取大肠杆菌质粒DNA提取参照《分子克隆实验指南》第二版(1989)小量碱法进行[7]｡芽孢杆菌的总DNA按照如下方法提取｡将芽孢杆菌单菌落接入LB培养基中,30℃ 200 r/min振荡培养4~5 h至OD600约0.6~0.8,取1.5 mL菌液至Eppendorf 管中,离心收集菌体,用TES缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl､pH值为8.0,5 mmol/L EDTA､pH值为8.0,20%蔗糖)洗涤菌体1次,沉淀中加入500 μL含10 mg/mL溶菌酶的TES,混匀后37℃下作用1.0~1.5 h至菌体形成原生质球,加100 μL 10% SDS 溶液及终浓度为2 mg/mL的蛋白酶K,上下颠倒数次混匀,37℃下作用1 h,12 000 r/min离心10 min,上清加等体积的酚氯仿抽提后,加入两倍体积预冷无水乙醇温和混匀,-20℃放置30 min左右后12 000 r/min离心10 min,沉淀用70%乙醇洗涤,风干,最后溶于含2 mg/mL RNA酶的适量的无菌去离子水中｡1.4几丁质酶基因的PCR扩增根据GenBank中Bt以色列亚种几丁质酶基因(GenBank序列号为AF526379)全序列设计了扩增引物[8],ICHI1 5′-GTCGACTTTCCTCCCATACCA-3′(带SalⅠ酶切位点),CCHI1 5′-GGGGCATGCATGCCTTAAATATATC-3′(带EcoRⅠ酶切位点),CCHI2 5′-GGGGCATGCATGCCTTAAATATATC-3′(带HindⅢ酶切位点)｡扩增体系为:芽孢杆菌总DNA 0.1 μg,1×PCR Buffer 2.5 μL, 2.5 pmol dNTPs,Taq plus(Taq+pfu DNA polymerase)1 U,引物各10 pmol,加ddH2O至25 μL｡扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,50℃退火3 min,72℃延伸3 min,28个循环;72℃延伸7 min｡1.5几丁质酶基因的克隆以Bt菌株T04A001总DNA为模板,ICHI1/CCHI2为引物,PCR扩增得到包含启动子和chiAC基因ORF和终止子的几丁质酶全长基因,将PCR产物(为确保PCR 产物末端加上了A残基,扩增完成后直接向PCR反应管中加入1U Taq DNA polymerase,72 ℃延伸30 min),用PCR产物回收试剂盒纯化回收后连接到PCR产物克隆载体pMD18-T上,连接产物转化进E. coli DH5α,在氨苄青霉素抗性LB平板上挑取白色克隆子,提取质粒酶切鉴定,得到T04A001几丁质酶基因的正确克隆子E-pMDC26,送往上海博道生物公司测序｡1.6用于几丁质酶基因原核表达的重组质粒的构建以CCHI1/CCHI2为引物PCR扩增得到不含启动子序列的chiAC基因ORF,其两端分别带有EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,PCR产物经PCR产物回收试剂盒纯化回收后EcoR I/Hind Ⅲ双酶切｡双酶切后的PCR片段与表达质粒pET28a EcoRⅠ/Hind Ⅲ酶切后的片段连接,将连接产物转化E.coli DH5α后在卡那霉素抗性LB平板上筛选克隆子,随机挑取菌落提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确的质粒即为chiAC基因在质粒pET28a T7启动子控制下表达的重组质粒,命名为pETC21｡1.7几丁质酶的诱导表达及蛋白质纯化将质粒pETC21转化E. coli BL21,得到用于诱导表达的重组菌株E-pETC21｡E-pETC21接到5 mL LB液体培养基中,30℃震荡培养(200 r/min)过夜,按1∶1 000比例转接到500 mL的新鲜LB中,当菌液培养至OD600约0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导继续培养4 h,取样处理后经His-bind亲和层析试剂盒纯化得到表达的几丁质酶｡具体纯化方法见试剂盒说明｡考马斯亮蓝G250染色法测定纯化的蛋白质浓度｡3,5-二硝基水杨酸测定几丁质酶活力[6]｡一个酶活力单位(U)定义为合适温度下每小时产生1 μg还原糖的酶量｡1.8抗血清制备和Western blot分析约400 ng的纯化的ChiAC蛋白质经SDS-PAGE分离､考马斯亮蓝染液染色､脱色后,将70 kDa目的蛋白带切下,冻融3次,用研钵研碎,悬浮于1 mL生理盐水中｡蛋白样品制备好后,注射兔子进行免疫反应｡2周后加强一次注射免疫,1个月后再一次加强,1个半月后取兔血,离心得到70 kDa ChiAC的抗血清｡制备E-pET28a菌体破碎后的可溶性部分0.5 mL,与10 mL抗血清在4℃孵育过夜,然后3 000 r/min 离心3 min,除去所有抗原抗体凝集反应的沉淀,得到去除宿主菌杂抗体的抗血清｡本研究经摸索后确定Western blot分析均用1 000倍稀释度的ChiAC抗血清进行一抗杂交｡Western blot方法按《分子克隆实验指南》[7]进行｡2结果2.1几丁质酶基因和氨基酸序列分析序列测定表明,Bt菌株T04A001的几丁质酶基因编码序列(GenBank登录号为EF427670)由2 031个核苷酸组成,是编码676个氨基酸的74 kDa蛋白质｡与GenBank中其他ChiA家族几丁质酶基因进行核酸序列比对,菌株T04A001(H4血清型)几丁质酶基因chiAC的全序列与B. thuringiensis subsp. israelensis(H14血清型)几丁质酶基因ichi相似性最高,为99%;与B. thuringiensis subsp. konkukian(H34血清型)几丁质酶基因Bt及B. thuringiensis subsp. kenyae(H4a4c血清型)几丁质酶基因chiA74相似98%;与B. thuringiensis subsp. sotto(H4a4b血清型)几丁质酶基因Bts相似96%;与B. thuringiensis subsp. pakistani(H13血清型)几丁质酶基因chiA71相似80%;与枯草芽孢杆菌几丁质酶基因Bsu相似42%;与地衣芽孢杆菌TP菌株几丁质酶基因Bl相似28%;与S. marcescens菌株141 几丁质酶基因Sm相似7%(见图1)｡将chiAC翻译得到的蛋白序列ChiAC与GenBank中其他Bt菌株的几丁质酶进行比对,结果显示ChiAC与其他Bt菌株的几丁质酶存在高度相似性,与 B. thuringiensis subsp. pp在ChiAC的N端,首先是一段34氨基酸的信号肽,该信号肽能被革兰氏阳性菌､革兰氏阴性菌以及其他原核生物识别,在革兰氏阴性菌中其断裂位点是Leu-33和Ala-34,在革兰氏阳性菌和其他原核生物中其断裂位点是Ala-34和Asp-35｡其后为催化区,该结构域在Bt菌株的几丁质酶中高度保守,与几丁质酶活性相关的Asp-207､Asp-209和Glu-211高度保守｡催化区之后为两个纤粘蛋白相似区(Fbronectin-like domain,FLD),尽管两个FLD相互之间相似性很低(10%左右),但均含有粘蛋白的典型保守氨基酸残基(FLD1:Trp-373､Tyr-384和Tyr-411;FLD2:Trp-507､Tyr-519和Tyr-546)｡在Bt菌株的几丁质酶中,仅巴基斯坦亚种几丁质酶不含FLD1,其余几丁质酶FLDs的相似性均达到90%以上｡在FLDs 之后为位于C端的几丁质结合区,其保守残基为Trp-591､Tyr-595和Trp-626,Bt菌株的几丁质酶的该结构域相似性也均达到90%以上｡2.2chiAC基因在T7启动子下的表达几丁质酶基因chiAC ORF插入载体pET28a,得到chiAC基因ORF在T7启动子调控下的重组表达质粒pETC21,转进E. coli BL21中,得到重组菌株E-pETC21｡对E. coli BL21､E-pET28a､E-pETC21全菌体和纯化的几丁质酶进行SDS-PAGE 和Western blot分析,原始菌株E. coli BL21和转化空载体的对照菌株E-pET28a 均不产生几丁质酶,而E-pETC21及由其所提取的几丁质酶均能观察到ChiAC蛋白质对应的70 kDa表达带,同时还可观察到两条大小分别约40 kDa和29 kDa的降解蛋白质条带(图2)｡2.3在E-pETC21中的表达时相分析同时接种两瓶E-pETC21培养,当培养4 h时OD600均达到约0.6,此时在一个摇瓶中加入1 mmol/L IPTG继续培养,另一瓶则不加IPTG用作对照｡由图3可知,在加入IPTG诱导后菌株的生长明显受到抑制,菌体OD600最高仅能达到0.8左右,而未加IPTG诱导的菌体OD600可达到1.1左右｡诱导后菌株的几丁质酶产量显著增强,且随培养时间的延长不断增长,直至培养100 h左右酶活最高可达到约420 U/mL,之后酶活逐渐下降;而未诱导的E-pETC21虽然也能表达产生几丁质酶,但其产量不高,酶活最高仅能达到100 U/mL｡3讨论本研究所克隆的Bt菌株T04A001的几丁质酶基因chiAC包括启动子､编码区和终止子序列,其编码区由分泌信号肽､催化区､FLDs和几丁质结合区4个结构域组成｡蛋白质前体的信号肽符合原核生物信号序列特点,即N末端带电荷,其后形成一个疏水中心以及极性氨基酸串｡成熟的ChiAC蛋白质的N端存在一个催化区,与糖基水解酶18家族的催化区有较高的同源性,其中D207､D209､E211高度保守,可能是质子供体｡催化区后有两个与Fn Ⅲ结构域有同源性的区域——FLDs｡该结构域对几丁质酶与几丁质的结合作用无影响,却与胶状几丁质降解程度有关｡目前已在Bacillus sp.､Streptomyces sp.等细菌的几丁质酶中发现了FnⅢ同源结构域｡除几丁质酶外,α-淀粉酶､纤维素酶､PHB解聚酶等也存在FnⅢ同源结构域｡在进行氨基酸序列比对时发现,在其他结构域高度相似的情况下,同时具有FLD1和FLD2的Bt菌株的几丁质酶ChiA74为内切酶,而缺少FLD1区域的ChiA71却为外切酶,因此推测FLD1可能影响了几丁质酶的水解切口部位,同时推测与ChiA74相似度达99%且具有FLD1的ChiAC也为内切酶｡ChiAC蛋白C端几丁质结合区中的芳香族氨基酸——酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)也是高度保守的,该结构域能特异结合不可溶几丁质(如胶状几丁质或再生几丁质)及晶体几丁质,却不能与可溶性几丁质及其他不溶性多糖结合｡几丁质酶基因chiAC在载体pET28a的T7启动子调控下能够诱导表达,虽然其自身具有较高的本底表达水平,但在IPTG诱导下,几丁质酶产量能够得到显著且迅速的提高｡表达的几丁质酶在胞内和胞外都能检测到｡对菌体进行时相SDS-PAGE分析显示,在37℃诱导培养时,加入1 mmol/L IPTG后的最初2 h内可观察到逐渐增强的70 kDa表达蛋白质条带,但之后继续培养,则表达带的强度保持不变(数据未显示)｡对比酶活时相检测诱导后酶活不断增强的结果,表明在大肠杆菌中诱导表达的几丁质酶主要分泌到了胞外｡此外,在SDS-PAGE和Western blot分析中,重组菌株在表达产生70 kDa几丁质酶ChiAC的同时还产生两条大小分别为40 kDa左右和29 kDa左右的蛋白质条带,推测它们是70 kDa ChiAC的降解产物｡参考文献:[1] 冯波. 微生物几丁质酶的研究概况[J]. 天津师范大学学报(自然科学版),1998,18(3):50-56.[2] 冯俊丽,朱旭分. 微生物几丁质酶的分子生物学研究[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版),2004,30(1):102-108.[3] 卢伟,蔡峻,陈月华.苏云金芽孢杆菌几丁质酶的研究进展[J]. 微生物学通报,2007,34(1):143-147.[4] 邱立友.微生物几丁质酶与害虫防治[J].河南农业大学学报,1995, 29(2):184-191.[5] SAMPSON M N,GOODAY G W. 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开设研究创新型实验的探索和实践摘要：本文介绍了南开大学实验教学中心为了提高学生的实践能力和创新能力，努力为学生开设研究创新型实验的探索和实践。
关键词：研究创新型实验；学生；实验教学如何开设“研究创新型实验”?如何通过这种类型、这种层次的实验提高学生的创新意识和创新能力?对此，我们进行了多年的探索和实践。
在此基础上，创立了以学生独立进行科研项目研究的“研究创新型实验”，形成了有一定特色的“研究创新实验课”，并纳入实验教学体系。
一、以科研为载体设置“研究创新型实验”探索和实践使我们认识到，科学研究是设置“研究创新型实验”最大的平台。
也是学生作“研究创新型实验”最好的课堂。
基于这种认识，我们把实验教学与科研紧密结合，把科研内容和科研成果融入实验教学，设置了以科研项目研究为主要内容的“研究创新型实验”。
学生自己查阅文献，自己选择科研项目，自己进行项目研究，自己撰写研究论文或申请专利。
科研过程就是一门极好的、高质量的“研究创新实验课”。
以科研为载体的“研究创新型实验”，其特点是创新型、设计型和综合型。
因此，它是培养学生创新思维、创新能力、自我设计能力以及提高综合素质的高层次实验。
为实施因材施教与个性化培养，为激励学生广泛参与，我们为学生开设了学分与非学分、必修与选修、课上与课下不同形式的“研究创新型实验”。
每年以不同形式作“科研创新型实验”的学生多达百余人，深受学生欢迎。
二、开设不同形式的“研究创新型实验”近几年来，主要开设了四种不同形式的“研究创新型实验”。
1、研究式实验教学我们不断将科研内容和科研成果纳入实验课堂教学。
“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白(ICP)基因的检测”、“少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因PCR扩增”、“长春花愈伤组织诱导及吲哚生物碱的提取测定”、“聚羟基脂肪酸酯的发酵及产物分离纯化”、“植物根茎维管组织过渡区的研究”、“微生物多糖黄原胶的摇瓶发酵和提取”等多项实验内容，皆是由科研内容和科研成果转化而来。
