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苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. kurstaki）是一种常见的土壤细菌，被广泛应用于农业领域的生物杀虫剂中。
其杀虫作用主要来源于其产生的毒素，其中包括Cry（crystal）蛋白家族。
Cry蛋白是一类孢粉结晶蛋白，由于其高度的昆虫特异性和高毒性特点，被广泛应用于农业昆虫的防治。
不同的昆虫对Cry蛋白的敏感性存在较大差异。
为了提高其杀虫活性，进行Cry蛋白的改良和优化成为研究的一个热点。
在这篇文章中，我们主要关注苏云金芽孢杆菌的Cry1Da5基因的克隆与表达。
Cry1Da5是Cry蛋白家族的一员，对某些害虫如烟草霜霉病虫（Manduca sexta）具有较高的毒杀活性。
研究其基因的克隆与表达，有助于深入理解其杀虫机制，并为其应用于农业防治提供理论基础。
我们从苏云金芽孢杆菌中提取其基因组DNA，并使用特异引物进行PCR扩增Cry1Da5基因。
扩增产物通过凝胶电泳检测，保证其质量和纯度。
随后，我们将Cry1Da5基因克隆至适当的表达载体中。
常用的表达载体有原核表达系统和真核表达系统。
对于Cry1Da5基因的克隆与表达，我们通常采用原核表达系统。
这是因为苏云金芽孢杆菌本身就是一种原核细菌，其表达机制更为适合于Cry1Da5基因的表达。
在克隆至表达载体后，我们进行质粒酶切鉴定，确保正确的基因序列被克隆。
接着，我们将Cry1Da5基因的表达载体转化至表达宿主中，如大肠杆菌（Escherichia coli）中。
经过适当的培养和诱导条件，Cry1Da5基因的表达产物将被大肠杆菌表达出来。
我们对表达产物进行纯化和鉴定。
一般来说，我们采用亲和层析技术，如镍柱层析，使Cry1Da5蛋白与特定标签结合，然后经过洗脱和浓缩得到纯化的Cry1Da5蛋白。
我们对纯化的Cry1Da5蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，确定其纯度和分子量。
通过以上的实验步骤，我们成功地克隆和表达了苏云金芽孢杆菌的Cry1Da5基因。
苏云金芽孢杆菌的研究摘要苏云金芽孢杆菌是目前应用最广泛、研究最深入、生产量最大的微生物杀虫剂。
目前已发现多种Bt亚种或血清型对害虫具有杀虫活性,同时也发现了一些新的杀虫晶体蛋白，通过纯化得到高效的杀虫晶体蛋白也是目前研究热点之一。
本文简要介绍了Bt的发展历史、晶体蛋白的纯化及在杀虫方面的一些应用。
关键词苏云金芽孢杆菌、历史、伴孢晶体、杀虫苏云金杆菌(Bacillu .thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。
在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体,且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[15]。
苏云金杆菌是一种应用广泛的绿色环保型微生物杀虫剂，全世界年产值已突破1亿美元[1]。
自20世纪60年代实现工业化生产以来,已成为世界上用途最广、商业开发最成功、产量最大的微生物杀虫剂,每年以20%的速度增长[2,3]。
苏云金杆菌杀虫剂的稳定性较差、残效期短、杀虫速度慢等问题都待解决，关于苏云金芽孢杆菌的研究都将继续进行。
1Bt的发展历史1901年，日本学者石渡繁胤(Ishiwata)从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus.thuringiensis var.sott) 成为苏云金杆菌研究的起点[4]。
1911年，Berliner 发现一杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌(Bacil-lus.thuringiensis)，指明苏云金杆菌含伴孢晶体(Paraspora crystl) 。
1938年，苏云金杆菌商品化，用于防治地中海粉螟。
20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。
从发现该菌至今已有整整105年历史,世界上有超过万篇的研究报道,涉及生物学、分类命名、有效成分、杀虫机理、分子生物学、遗传学、产品化和安全性,包括近年来的转基因植物等诸多方面[5]。
1953年，Hannay第一次发现苏云金杆菌的杀虫活性与伴孢晶体有关，并和Fitz-James于1955年证实，伴孢晶体是一种蛋白质。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达引言农业是国民经济的基础，而农作物的病虫害是限制农业生产发展的主要因素。
为了有效地解决农作物病虫害问题，生物农药逐渐受到了广泛的关注。
昆虫杀菌蛋白是一种使昆虫产生瘫痪和死亡的天然蛋白质，具有高效、低毒、无残留等特点，已成为农作物病虫害防治的主要手段之一。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种广泛应用于农业生产的昆虫杀菌剂，其产生的杀虫晶体蛋白 (Cry) 具有高昆虫杀虫活性。
目前，cry1Da5基因已被广泛应用于转基因农作物中，以抵抗害虫的侵袭。
对cry1Da5基因的进一步研究具有重要的理论意义和应用价值。
一、cry1Da5基因的结构与功能cry1Da5基因是一种来源于Bt的昆虫杀虫晶体蛋白基因，具有较高的杀虫活性。
该基因编码的蛋白质主要是通过对昆虫肠道产生毒素作用，从而导致昆虫死亡。
cry1Da5基因包含了完整的起始密码子和终止密码子，编码长度为3696bp，由1231个氨基酸组成。
其蛋白质的生物活性主要是通过对昆虫肠道的结构和功能起着作用，造成昆虫肠道上皮细胞膜的破裂，使得肠腔内容物泄漏，从而导致昆虫死亡。
二、cry1Da5基因的克隆1. DNA提取从已储存的Bt cry1Da5基因菌株中提取基因组DNA。
首先采用细菌培养液对细菌进行扩大培养，然后采用离心法收集菌体，进行细胞裂解，最后利用琼脂糖凝胶电泳进行DNA 的提取。
2. PCR扩增设计引物对cry1Da5基因进行PCR扩增，将cry1Da5基因从基因组DNA中特异性扩增出来。
PCR扩增条件设定如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；72℃最后延伸10min。
通过PCR扩增的cry1Da5基因产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增的片段大小。
3. 克隆与测序将cry1Da5基因PCR扩增产物与质粒进行连接，然后转化大肠杆菌进行转化。
本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。
由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。
完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。
例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。
第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。
第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。
上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。
在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。
基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。
微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。
这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。
杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。
目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。
尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。
苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种选育和制剂研究的开题报告题目：苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种选育和制剂研究一、研究背景和意义苏云金芽孢杆菌是一种常见的土壤细菌，其在工业生产、农业、医疗等领域均有广泛应用。
近年来，研究发现苏云金芽孢杆菌的毒力较强，可用作生物农药、生物防治等方面的原料。
因此，针对苏云金芽孢杆菌高毒菌株的选育和制剂研究具有重要的理论和应用意义。
二、研究内容和目标本研究旨在通过苏云金芽孢杆菌的高毒菌株菌种选育和制剂研究，深入探究其毒力增强的机理以及其应用于生物农药和生物防治中的潜在价值。
具体研究内容如下：1. 筛选苏云金芽孢杆菌中毒力高的菌株；2. 建立苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种增殖、分离和纯化技术；3. 研究苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种代谢产物的结构与功能；4. 研究苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种的生长环境影响及适应机理；5. 研制苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种的生物农药和生物防治制剂。
三、研究方法和技术路线本研究采用实验室筛选法和分子生物学技术结合的方法，通过菌株筛选、培养增殖、分离纯化等方法研究苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种的生理特性、代谢功能及生态适应等问题。
具体技术路线如下：1.苏云金芽孢杆菌菌株筛选：通过对不同来源、不同环境条件下的菌株进行筛选，达到获得毒力高的菌株的目的。
2.菌株的增殖、分离和纯化技术：采用传统培养和高密度发酵技术等方式进行大规模菌种增殖，采用菌落计数法和电子显微镜观察等手段进行纯化和分离。
3.代谢产物结构与功能研究：采用NMR、MS等技术手段对不同培养条件下的代谢产物进行结构鉴定，并进一步研究其生物活性及应用潜力等问题。
4.生长环境影响及适应机理研究：采用高通量测序技术对不同生长环境下的苏云金芽孢杆菌高毒菌株进行全基因组分析，研究其生态适应机理。
5.生物农药和生物防治制剂的研发：通过将苏云金芽孢杆菌高毒菌株菌种提取并制成不同类型的生物农药和生物防治制剂，探究其在生物防治领域的应用潜力。
苏云金芽胞杆菌—开放的基因组与多种功能AbstractAs an important biological insecticide，Bacillus thuringiensis has been widely used to control agricultural，forest and medical insect pests. Bt toxin genes have also been extensively used as gene source in genetically modified crops. In recent years，with the development of science，technology and social demands，some other new functions of Bt have been explored，including resistance to nematodes，antagonistic effects against plant pathogenic fungi and bacteria，plant growthpromoting activities，and environmental bioremediation. Based on the pangenome analysis and genetic peculiarity of Bt，we reviewed recent advances in Bt insecticidal genes，and analyzed the relationship between pangenome and various new functions of Bt，in order to provide a guide for the research and application of Bt in China.Key wordsBacillus thuringiensis；pangenome；insecticidal gene；antagonistic effect；plant growthpromoting rhizobacteria （PGPR）；environmental bioremediation苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis （Bt）是革兰氏阳性的昆虫病原细菌，可产生芽胞及多种杀虫活性物质，在害虫防治方面的研究与应用一直是人们关注的热点。
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第202－208页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,202－208专题介绍Review苏云金芽孢杆菌基因组研究概况谭寿湖1,3张文飞1,3叶大维2*1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2南开大学生命科学院,天津,300071;3海南海德热带农业资源研究所,三亚,572025*通讯作者,yehtawei@摘要迄今为止，全球已有2个Bt 株菌株完成了全基因组测序，1个Bt 菌株正在拼接中，15个Bt 菌株正在进行测序中。
已有22个Bt 质粒完成了全序列测定。
Bt 是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。
在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。
本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。
关键词苏云金芽孢杆菌,Bt 基因组,质粒基因组,比较基因组Summary of Research Progress in the Genomics of Bacillus thuringiensisTan Shouhu 1,3Zhang Wenfei 1,3Ye Dawei 2*1College of Life and Technology Science,Guangxi University,Nanning,530005;2College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin,300071;3Haide Institute of Tropical Agricultural Resources,Sanya,572025*Corresponding author,yehtawei@Abstract Presently,there are two Bt strains that have completed whole genomic sequencing,while one Bt strain is being assembled,and 15Bt strains are in progress.Furthermore,22Bt plasmids have completed sequencing.Bt is the most widely used microbial strains as a biological pesticide and also have the most successful application in genetically modified plant with the use of its insecticidal protein gene.Scientists have been looking at the genomic evolution,new gene discovery,gene expression and regulation with considerable achievements.This article pro-vides an overview on the latest research development of Bt genome sequencing,genome characteristics and com-parative genomics studies.KeywordsBacillus thuringiensis ,Bt Genome,Plasmid genome,Comparative genome基金项目：本研究由国家863项目(2006AA022189)资助随着基因组测序技术的快速发展，测序成本的降低，对任何生物的基因组进行测序变得现实和可能(Marguerat et al.,2008)。
自1995年首次完成流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae )的全基因组序列以来，已有大量的微生物菌株基因组全序列测定完成。
截止到2009年2月3日，全球已经完成基因组测序的微生物菌株有834株，有643株微生物菌株的基因组正处在拼接阶段，此外，有797株微生物菌株的基因组由于各种原因只完成了基因组草图。
在已经完成测序的微生物中，有779株为真细菌，55株为古生菌(/genomes/lproks.cgi)。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt )在《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)中被列为第2类第18群中的芽孢杆菌属。
与蜡状芽孢杆菌(B.cereus )，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis )同属于蜡状芽孢杆菌群细菌(Rasko et al.,2005)。
Bt 广泛存在于土壤、虫尸、污水、淤泥、尘埃以及叶面等介质中，是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性细菌。
苏云金芽孢杆菌也是一种典型的昆虫病原菌，对鳞翅目(Lepidoptera )、双翅目(Diptera )、鞘翅目(Coleoplera )、膜翅目(Hymenoptera )、同翅目(Ho －moptera )、直翅目(Orthoplera )、食毛目(Mallophaga )等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异的毒性活性，由此成为目前世界上研究最深入，应用最广泛的农业害虫生物防治细菌(Crickmore et al.,1998;喻子牛等,1996)。
1苏云金芽孢杆菌基因组测序概况迄今为止，已有2个Bt菌株完成了全基因组测序，1个Bt菌株正在拼接，15个Bt菌株正在进行测序中(表1)。
第一个完成全基因组测序的苏云金芽孢杆菌菌株是B.thuringiensis97－27。
它的序列测定工作由设立在加利福尼亚的美国能源部联合基因组研究所(DOE Joint Genome Institute)于2004年6月30日宣布完成。
事实上，该菌株是从人体的坏死组织上分离得到的，并被认为是能够引起人体感染的病原菌。
AFLP和MLST的分析也显示该菌株在种系发生树上与炭疽芽孢杆菌更为接近。
之所以把它归类为苏云金芽孢杆菌，是因为该菌株能够产生Bt菌所特有的伴孢晶体，且各项生理生化指标与Bt菌的极为相似。
令人惊奇的是该菌株没有任何的杀虫活性，利用已知的杀虫基因序列对该基因组序列进行Blast，没有发现任何已知cry、cyt或vip基因或这些基因的同源基因(Hernandez et al.,1998;Rasko et al.,2005)。
显然，B.thuringiensis97－27菌株是不是一株典型意义上的苏云金芽孢杆菌值得商榷。
另一株完成全基因组测序的苏云金芽孢杆菌菌株是B.thuringiensis Al Hakam。
该菌株由United Nations Special Commission收集于伊拉克的一个被怀疑为生化武器制造工厂(Al Hakam)(Radnedge et al., 2003)。
Bt Al Hakam的全基因组测序也是由美国能源部联合基因组研究所使用plasmid文库和fosmid文库方法完成的。
基因组全长5.31Mb，包含两个复制子：一个环形染色体(5.26Mb)，G+C含量为35%，至少编码4969个开放阅读框；一个pALH1质粒，G+C 含量为36%，编码62个开放阅读框。
不幸的是序列分析也没有发现任何已知cry、cyt或vip基因或这些基因的同源基因(Challacombe et al.,2007)。
苏云金芽孢杆菌YBT－1520的基因组测序是由华中农业大学与中国农科院植保所等在国家863计划的支持下进行的，由杭州华大基因研发中心承担测序工作。
Bt YBT－1520菌株是华中农业大学分离的一株高毒力Bt菌株。
其伴孢晶体对鳞翅目、双翅目、鞘翅目的昆虫，及螨类和动植物寄生线虫都有一定的毒性，其中，对小菜蛾和棉铃虫的毒力特别高。
Bt YBT－1520染色体全长为5402170bp，含有5639个可读框(ORF)，同时它还含有10个质粒，大小从2kb 到130kb不等。
已有的研究表明，Bt YBT－1520含有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab等5种杀虫晶体蛋白基因(刘超,2007)。
遗憾的是该菌株的全基因组序列拼接似乎存在困难，至今尚未见到完整序列的发表或报道。
在Integrated Genomics进行的苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis serovar israelensis)菌株ATCC35646的基因组测序也即将完成(Anderson et al.,2005)。
初步的数据显示该菌株的基因组大小为5880839bp。
DNA编码序列4649355bp，G+C含量35%，DNA contigs为866，ORFs总数为6 451个，其中有指定功能的有2103个。
2苏云金芽孢杆菌基因组结构及其特征苏云金芽孢杆菌染色体为环状DNA，GC含量一般在32%~35%之间，基因组大小2.4~5.7Mb不等(Schnepf et al.,1998)。
目前已经公开的关于苏云金芽孢杆菌全基因组的信息菌株有Bt serovar konkukian str.97－27和Bt str.Al Hakam，本文以Bt97－27为例，介绍Bt基因组结构及其特征(图1)。
B.thuringiensis97－27基因组全长5314794bp，G+C百分含量为35.1%。
包含两个复制子：一个环形染色体，至少编码5198个开放阅读框及一个pBT9727质粒。
Bt97－27染色体为环状单链DNA，大小为5237682bp。
G+C百分含量35%。
编码序列为4379823bp，约占整个染色体序列的84%。
ORF总数为5263，平均长度为856bp。
CDS总共有5118个，其中有3828个具有指定的功能，1198个编码保守的假定蛋白，即这些CDS在数据库中存在着功能未知的同源序列，其余的92个编码假定蛋白，即这些CDS 在数据库中找不到同源序列(Han et al.,2006)。
3苏云金芽孢杆菌质粒基因组结构及其特征苏云金芽孢杆菌的绝大多数野生菌株含有丰富多样的内生质粒，其质粒DNA的含量可以占到细胞总DNA含量的10%~20%(Aronson,1993)。
苏云金芽孢杆菌的内生质粒，在细胞内呈共价闭合环状的形式(cccDNA)，它们不仅在数量及分子大小上差异很大，而且这些内生质粒在拷贝数、复制方式及稳定性等特性上也尽不相同。
迄今为止，根据NCBI的数据统计，已有22个质粒完成了全序列测定(表2)。
