丹参酮ⅡA抑制非小细胞肺癌NCI-H520细胞生长的研究

新医学２０１３年５月第４４卷第５期　３４７　

基础研究论著　

丹参酮ⅡＡ抑制非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞生长的研究　

简晓顺　刘相富　陈健清　

［摘要］　目的：探讨丹参酮ⅡＡ抑制非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞生长及其分子机制。方法：　

用不同浓度的丹参酮ⅡＡ（０，５，１０，２０　Ｍ）处理非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞后，采用Ｍ１Ｔｒ　

法检测非小细胞肺癌ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞活力；采用流式细胞计检测非小细胞肺癌ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞周　

期；应用免疫印迹方法检测蛋白表达水平。结果：丹参酮ⅡＡ显著抑制非小细胞肺癌ＮＣＩ—Ｈ５２０　

细胞生长，并呈浓度依赖方式；流式细胞检测到丹参酮ⅡＡ处理非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞　

后，细胞周期ｓ期细胞比例较处理前显著增多（Ｐ＜０．０５）；免疫印迹实验检测到丹参酮ⅡＡ处　

理非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞后，细胞周期蛋白Ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ及ＣＤＫ２抑制剂Ｐ２７较处理前显著上　

调（Ｐ＜０．０５）。结论：丹参酮ⅡＡ可能通过上调Ｐ２７抑制ＣＤＫ２，导致非小细胞肺癌细胞ＮＣＩ．　Ｈ５２０细胞周期Ｓ阻滞。　

［关键词］　丹参酮ⅡＡ；非小细胞肺癌细胞；Ｐ２７；细胞周期　

Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　ｌＩ　Ａ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ＮＣＩ－Ｈ５２０　ｃｅｌｌｓ　ＪＩＡＮ　Ｘｉａｏ－ｓｈｕｎ，ＬＩＵ　Ｘｉａｎｇ－ｆｕ，ＣＨＥＮ　

Ｊｉａｎ－ｑｉｒＬ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ａｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　

５１００９５，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｂｙ　ｗｈｉｃｈ　ＴａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡ（ＴａｎⅡＡ）ｉｎｈｉｂｉｔｓ　

ｎｏｎ．ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ＮＣＩ．Ｈ５２０　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ａｆｔｅｒ　ｄｅａｌｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　ＩＩ　

Ａ（０，５，１０，２０　ＩｘＭ），ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＮＣＩ－Ｈ５２０　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＭＴｒ　ａｓ．　

ｓａｙ：Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ＮＣＩ－Ｈ５２０　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　ＩＩ　Ａ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｍｍｕｎｏｂ—　

ｌｏｔｔｉｎｇ　ｗａｓ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅ１．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　ｌＩ　Ａ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ　ｄｅｔｒｉｍｅｎｔｓ　ＮＣＩ．　Ｈ５２０　ｃｅｌｌｓ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ：ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮＣＩ－Ｈ５２０　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　

ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　Ｓ－ｐｈａｓｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　１Ｉ　Ａ．Ｆｕｒｔｈｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　

ｏｆ　ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ　ａｎｄ　ＣＤＫ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｐ２７，ｉｎ　ＮＣＩ．Ｈ５２０　ｃｅｌｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　ＩＩ　Ａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ　ＩＩ　

Ａ　ａｒｒｅｓｔｅｄ　ＮＣＩ－Ｈ５２０　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｔ　Ｓ　ａｒｒｅｓｔ　ｍａｙｂｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ２７　ｗｈｉｃｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ＣＤＫ２．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ＴａｎｓｈｉｎｏｎｅⅡＡ；Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ；Ｐ２７；Ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，也是所有　

肿瘤中病死率最高的肿瘤　。在所有诊断病例中　非小细胞肺癌约占８７％＿２　Ｊ。目前，肺癌常规治疗　

手段主要有手术、放射治疗和化学治疗等，均有一　

定的疗效，但以上均远不能满足临床的需要，很多　

患者最终仍死于肿瘤复发和转移　Ｊ。因此，对抗　

肺癌药物的筛选及其机制的探讨，继续寻找肺癌治　

疗新的有效靶点显得十分迫切。　

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｇ．ｉｓｓｎ．０２５３－９８０２．２０１３．０５．０１４　基金项目：广东省医学科研基金（Ｂ２０１２１７１）　作者单位：５１００９５广州，广州医学院附属肿瘤医院药学部（简　晓顺，陈健清）；５１０６３０广州，中山大学附属第三医　院输血科（刘相富）　丹参酮ⅡＡ为丹参根部乙醚或乙醇提出物，传　统药理认为其具有抗炎活性以及抗氧化功效　４　。　

近年来的研究表明丹参酮ⅡＡ具有杀伤肿瘤细胞、　促进凋亡、抑制侵袭转移的作用，特别是其能诱导　

肿瘤细胞分化等机制而发挥抗肿瘤作用，因此引起　

广泛关注　。然而，丹参酮ⅡＡ抗癌的确切作用　机制尚待明确。笔者检测了丹参酮ⅡＡ对非小细胞　

肺癌细胞系ＮＣＩ－Ｈ５２０生长抑制的作用，进而探讨　了丹参酮ⅡＡ诱导ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞周期阻滞的分子　

机制。

　新医学２０１３年５月第４４卷第５期　

材料与方法　

一、样本来源　

人非小细胞肺癌细胞株ＮＣＩ—Ｈ５２０为实验室保　

存细胞株，置于１０％胎牛血清的１６４０完全培养　

基，在３７％，５％二氧化碳培养箱中培养。　

二、主要试剂和仪器　

ＤＭＥＭ细胞培养基，胎牛血清购自美国ＧＩＢ．　

ＣＯ公司；丹参酮ⅡＡ（纯度＞９７％）和ＭＴＴ购自　Ｓｉｇｍａ公司；Ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ和Ｐ２７抗体购自Ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ公　

司；Ａｃｔｉｎ单抗购自ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ公司。流式细胞仪　

为Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ产品；免疫印迹转印电泳仪为　

北京六一仪器厂产品；激光共聚焦显微镜为Ｌｅｉｃａ　仪器公司产品。　

三、实验方法　

首先，采用不同浓度的丹参酮ⅡＡ（０、５、　

１０、２０　ＩｘＭ）处理培养于９６孔板的ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞　

２４　ｈ后，采用Ｍ　ｒＩＴＩ１方法检测丹参酮ⅡＡ对非小细　

胞肺癌ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞毒性作用。　

１　ＭＴＴ法　

ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞以每孔１×１０　接种到９６孔板培　养２４　ｈ；分别用不同浓度丹参酮ⅡＡ（０、５、１０、　

２０　ＩｘＭ）处理细胞２４　ｈ，每种浓度并列设３个孔；　

小心弃上清液每孔加入无血清ＭＴＴ（０．５　ｍｇ／ｍ１）　

１００　Ｌ，放入培养箱继续孵育４　ｈ后，小心弃上清　液，加入１５０　ｔｘＬ　ＤＭＳＯ，振荡使沉淀融解，酶标　

仪中５７０　ｎｍ下测定其吸收值。未经处理的ＮＣＩ．　

Ｈ５２０细胞作为对照。实验重复３次。　

２细胞周期分析　

将ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞以１０×１０　／ｍＬ的密度接种６　

孔板，每孔１　ｍＬ；分别用不同浓度丹参酮ⅡＡ（０、　

５、１０、２０　ＩｘＭ）处理细胞２４　ｈ，每种浓度并列设３　

个孔；收集细胞，每管加人１　ｍｌ预冷的７０％乙醇　

固定；离心，弃上清液后每管加４００　ｌ　ＰＢＳ，１４０　

ｌ　ＰＩ，１Ｏ　Ｉｘｌ　ＲｎａｓｅＡ溶液，３７℃避光孵育３０　ｍｉｎ，　

上机检测。　

３免疫印迹　将ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞以１０×１０　／ｍｌ的密度接种６　

孔板，每孔１　ｍｌ，分别用不同浓度丹参酮ⅡＡ（０、　

５、１Ｏ、２０　ＩｘＭ）处理细胞２４　ｈ，每种浓度并列设３　

个孔；收集细胞，每组加入１００　ｌ　ＲＩＰＡ提取总蛋　

白，经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳后，转移到ＰＶＤＦ膜上，用　

５％脱脂奶粉封闭；分别加入一抗Ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ和Ｐ２７，　８一ａｃｔｉｎ作为内参，４　孵育过夜；根据一抗来源加　入相应的二抗，常温孵育１　ｈ；洗膜，曝光，显影，　

并时行扫描分析。　

四、统计学处理　

采用ＳＰＳＳ　１６．０统计数据，计量资料用ｘ±Ｓ表　

示，采用方差分析，并用最小有意义差异ｔ检验进　

行均数间的多重比较，检验水准Ｏｔ＝０．０５。　

多士　甲　＝口７ｌ　

一、丹参酮ⅡＡ对非小细胞肺癌ＮＣＩ－Ｈ５２０　

细胞的毒性　

结果如图１所示，５、１０、２０　Ｍ浓度的丹参　酮ⅡＡ处理后非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞相对于　

对照组（０　ＩｘＭ组）活力百分比分别为（６６．３±　２．０５）％、（５０．８±１．６７）％、（３０．０％±１．５２）％　

（ｔ值分别为３０．５８、３８．６７、４６．５５，Ｐ均＜０．０５）。　

由此可计算出丹参酮ⅡＡ处理２４　ｈ对非小细胞肺　癌ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞的半数抑制浓度（ＩＣ５０）约为ｌ０　

ＩｘＭ。以上结果表明，丹参酮ⅡＡ能够以浓度依赖　方式显著抑制非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞的生　

长。见图１。　

／＾、　、－，　

烬　掣　恩　

０　５　１０　２０　丹参酮ＩＩＡ（　）　

图１丹参酮ⅡＡ对ＮＣＩ－Ｉ－￣２０细胞活力影响　如图所示为丹参酮ⅡＡ组相对于对照组的相对活力　（对照组活力为１００％）　二、丹参酮ⅡＡ对非小细胞肺癌ＮＣＩ－Ｈ５２０　

细胞周期影响　

细胞毒性药物往往能够搅乱细胞生长周期，为　了阐明丹参酮ⅡＡ对非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞　

生长的影响，我们应用ＰＩ染色法流式细胞分析不　

同浓度丹参酮ⅡＡ处理前后非小细胞肺癌ＮＣＩ—　

Ｈ５２０细胞周期变化。结果显示：设５、１０、２０　ｔｘＭ　

的浓度梯度丹参酮ⅡＡ处理非小细胞肺癌ＮＣＩ．　

Ｈ５２０细胞２４　ｈ后，其细胞周期Ｓ期细胞比例分别　

从０　ＩｘＭ时的（１３．５±１．７５）％增力Ⅱ至０（１７．２±　

２．２２）％、（２６．３±２．８６）％和（３３．４±１．６７）％　

加　∞　跚　∞　加　∞　０　３５０　新医学２０１３年５月第４４卷第５期　

展，其中ＣＤＫ２是细胞周期正向调控因子，而　

ＣＤＫ２特异性的抑制剂是细胞周期负性调控因子。　并且免疫印迹也检测到Ｓ期Ｃｙｃｌｉｎ　Ｅ蛋白增多，相　

应印证了以上结果。那么，丹参酮ⅡＡ诱导ＮＣＩ—　Ｈ５２０细胞周期Ｓ期阻滞的分子机制是怎样的？文　

献报道Ｐ２７是ＣＤＫ２抑制剂，能介导细胞周期ｓ期　

阻滞　。因此，我们检测了Ｐ２７表达水平，结果　

表明丹参酮ⅡＡ处理非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞　

能引起Ｐ２７表达水平升高，提示两者可能介导丹参　

酮ⅡＡ诱导的非小细胞肺癌ＮＣＩ．Ｈ５２０细胞周期阻　

滞。　

我们的研究利用丹参酮ⅡＡ处理非小细胞肺癌　

ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞，诱导ＣＤＫ抑制剂Ｐ２７上调，为丹　

参酮ⅡＡ诱导非小细胞肺癌ＮＣＩ—Ｈ５２０细胞周期Ｓ　期阻滞提供候选机制。　

［２］　

［３］　

［４］　参考文献　

Ｊｅｍａｌ　Ａ，Ｓｉｅｇｅｌ　Ｒ，Ｗａｒｄ　Ｅ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｎｃｅｒ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，　２００９．ＣＡ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ　Ｃｌｉｎ，２００９，５９：２２５－２４９．　Ｓｉｄｄｉｑｕｉ　Ｓ，Ａｌｉ　ＭＵ，Ａｌｉ　ＭＡ，ｅｔ　ａ１．Ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：　

ｉｔｓ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ａｎｄ　ｃｈａｎｇｉｎｇ　ｔｒｅｎｄｓ．Ｊ　Ａｙｕｂ　Ｍｅｄ　Ｃｏｌｌ　Ａｂｂｏｔ—　ｔａｂａｄ，２０１０，２２：１１６—１１９．　Ｂｒｏｗｎ　Ｔ，Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ　Ｇ，Ｂｏｌａｎｄ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｆｆｅｃ—　ｔｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｆｉｒｓｔ—ｌｉｎｅ　ｃｈｅｍｏｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ａｄｕｌｔ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｌｏｃａｌｌｙ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｎｏｎ—ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ：ａ　ｓｙｓ—　ｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ．Ｈｅａｌｔｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ａｓｓｅｓｓ，２０１　３，１７：１—