小木虫 分离 过柱子经验

小木虫 分离 过柱子经验

柱层析浅谈

极性小的用乙酸乙酯:石油醚系统

极性较大的用甲醇:氯仿系统

极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统

拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

硅胶柱层析

下面介绍惯用的方法:匀浆法。

1。称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量;如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。

2。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。 3。装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚(氯仿)，装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。

4。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。 5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将 一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子:10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分;1-2g上样量，50g硅胶(200-300目)，20-50ml收一馏分。

7。检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。

8。送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。

1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化 2.将柱子必须装平整、均匀

3.考虑有限柱填料的吸附量

4.可考虑用剃度法分开并洗脱

关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。

柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄)，这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 现在见到的柱子径高比一般在1:5,10，书中写硅胶量是样品量的30,40倍，

具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2,0.4，杂质相差0.1以上)，就可以少用硅胶，用小柱子(例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子);如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 真空液相层析即vacuum liquid chromatography(VLC),即用真空代替压力进行层析，具体方法可见Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222-

干法上样，一般用于固体或粘度大的液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解，加入1-3倍的粗硅胶，晾干或旋干，干燥的标准是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好的柱子上留一段溶剂，把吸附了样品的硅胶慢慢到进去，震动柱子或再加一些溶剂，把粘在柱壁上的硅胶洗下常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。

柱子可以分为:加压，常压，减压。

压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结)，以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音，而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是

在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是 加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用GF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。

【主题】黄酮类化合物的分离体会

【实验过程】我做的是某中药的化学成分研究，该中药中主要为黄酮类成分，遵循传统用药原则，我采取水煎煮，之后水提液浓缩至一定体积，过大孔吸附树脂，乙醇水梯度洗脱，梯度:水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇。每个梯

度最为一个流分，再进行细分。下一步主要是运用聚酰胺柱色谱，中低压ODS，Sephadex LH20进一步分离，最好制备液相得到单体化合物。

【经验分享】主要和大家分享我使用聚酰胺柱的经验，我一般是聚酰胺薄膜结合聚酰胺柱，类似于硅胶板结合硅胶柱。所用的聚酰胺为30-60目，聚酰胺薄膜一盒50片，规格为8cm x 8cm，70块钱左右，可以根据需要剪成条状使用。聚酰胺薄膜常用的溶剂系统说明书上有，我常用甲醇-水，因为黄酮类化合物有一定的酸性，展开剂要加点酸，甲酸乙酸都可以，抑制其解离，保持游离状态的话，样品成点性好，否则拖尾很严重。在此需要指出的是，聚酰胺可以用反相溶剂系统，如甲醇水;也可以用正相溶剂系统，如二氯甲烷甲醇。要根据自己样品的极性来定。以我的80%乙醇洗脱物为例，进行详细的叙述。此部分极性较小。我用二氯甲烷溶解，拌样，挥干。洗脱系统为甲醇水，聚酰胺柱起始用水装柱，上样，上面要放一块棉花，然后用玻璃塞子压住(聚酰胺比较轻，防止加溶剂时冲起来)，甲醇水梯度洗脱。之前点板显示，50%甲醇水刚刚展开一点，因此起始用50%甲醇水洗脱，然后梯度设为55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、最后甲醇冲柱。过程中每100mL一接，蒸干转移至小瓶。最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。

【体会和教训】黄酮类化合物用聚酰胺分离效果非常好，但是死吸附较严重，样品比较多时可以使用，少就算了。凝胶Sephadex LH20效果也非常好，建议多使用。黄酮类成分溶解性比较折磨人，但提醒一点在进行制备液相时，样品一定要用流动相溶解，或接近流动相，多加点总会溶解的，然后用0.45μm滤膜过滤。不用流动相溶解很容易把柱子弄裂分。原因在于，进样之后，样品析出，堵了柱

塞板，导致局部流速过快，冲塌固定相。

【主题】一种中药的乙酸乙酯层浸膏的分离心得

【实验过程】课题是某中药的化学成分研究，通过立式真空压力消毒罐用70%乙醇提取三次，回收，萃取，硅胶，凝胶柱，以及高效液相色谱制备的方法得到单体，到打谱的全流程。

【经验分享】下面我要讲我的经验了。

课题拿来的时候就知道要分离，对于具体怎么分，分哪层没有什么具体概念，这里给大家一个提议，如果想让自己的分离有点价值，建议先把各层(石油醚层，乙酸乙酯层，氯仿层，正丁醇层，水层)先做药理看看哪层有活性，或者取总皂苷，总黄铜，总生物碱，总多糖等各组分做药理，看看哪个组分有活性，再具体的进行分离，不然分出来的东西，很多也不知道有没有活性，可能东西也比较少，不够做药理的，那样分离就没有有目标的分离意义大了。

1 预实验

(1)用少量的药提取，然后分层萃取，计算一下各层的出膏率，我分的乙酸乙酯层出高率就特别低，但是以前不懂也就分了，结果费了好多的药，分得的单体量还特别少，建议可以萃取完事之后进进液相看看，那层的峰多不多，大不大，心里大概有个数，如果峰都特别小，那可能分这层就很费劲，浸膏当然是越多越好分了，这里还要记住一点，就是分离和你以后要做含量测定以及药理的药要都是一批药，我因为用了两批药做分离，结果在第一批药里分得的东西，在以后用

第二批药的样品进高效液相的时候找不到那个峰，所以买药一定要买够，不然影响你以后做含量测定等一系列的东西。

(2)摸薄层条件，将提取好已经萃取的乙酸乙酯层用少量乙酸乙酯溶解，(这里具体用什么试剂溶解你可以自己摸摸，比如丙酮啊，氯仿啊，都行，目的是将浸膏最大程度的溶解，点板看看膏子里的各种成分)。一般乙酸乙酯层用到的展开剂配伍有:石油醚-乙酸乙酯 石油醚-丙酮 氯仿-丙酮 氯仿-甲醇 乙酸乙酯-甲醇 乙酸乙酯-氯仿 一般用3:1大概看看点的分离情况，如果有分开的迹象，就可以用这个展开剂调整比例，如果拖尾很严重，或者点分开的不是很好，那么建议换一个展开剂试试。摸好条件后，把样品中的第一个点降低展开剂的极性往下拉，使第一个点的RF=0.2 这个时候展开剂的比例就是初始溶媒了，也就是你以后要上大柱子的洗脱剂的初始比例。

2 正式实验

因为是大量提药，所以需要浓缩的浸膏液非常多 ，不要闲麻烦一定要用旋转蒸发仪，我就是直接在火上浓缩的，最后分出来的东西，跟样品有的对不上，怀疑是不是因为温度过高转化了，这个就不能确定啦。 好的浸膏用水融了之后放入一个貌似广口瓶的大罐子里 ，倒入跟浸膏液等体积的萃取液进行萃取，这里面要说一嘴，在用乙酸乙酯萃取的时候，禁止剧烈震摇，过于剧烈会让乙酸乙酯层产生非常强烈的乳化层，乳化层就不知道到底是上层的东西还是下层的东西了，轻轻摇的话乳化层会小一点，如果一旦产生乳化层了，可以用热抹布温一温瓶子外面，或者找个盆加热一下，大概50?左右把这个大罐子放里面，一会乳化层就下降了很多，不能说完全都变没了，只能说有好转。萃取好的浸膏液，减压浓缩，备用。