核酸与分子标志物共82页

A
U A
G
CCG
D DD
AA
GGC G
C
G
A
G
G
G
C CCCCC
U
C
A
C
GGGGG CDm
TΨ
C
A
GA C
AU
AU
G Cψ
(4) 不同的氨基酸需要不用的 tRNA进行运输：反密码子与携 带的氨基酸具有的对应性。
A
A
C U
G
U
A A A
反密码子环
反密码子
2. tRNA的三级结构
X线衍射结构证明，tRNA的共 同三级结构为倒L形。
脱氧核糖核酸
(deoxyribonucleic acid, DNA)
90%以上分布于细胞核，其余 分布于核外如线粒体，叶绿体，质 粒等。
携带遗传信息，决定细胞和个 体的基因型(genotype)。
核糖核酸
(ribonucleic acid, RNA)
分布于胞核、胞液。
参与细胞内DNA遗传信息的 表达。某些病毒RNA也可作为遗传
(三) tRNA的功能
1. 破译遗传密码〔反 密码子〕；
2. 活化、搬运氨基酸到 核糖体，参与蛋白质的翻 译〔氨基酸臂〕。
三、rRNA的结构与功能
(一) rRNA占总RNA的80％以上。
(二) rRNA由单链卷曲构成的多茎环结构。 (三) rRNA参与组成核糖体的大、小亚基，作为蛋白质生物合成的
➢ 由74～95核苷酸组成； ➢ 具有很好的稳定性。
(二) tRNA的结构
氨基酸臂 OH
A
1. tRNA的二级结构
C C
A
(1) tRNA的二级结构为平面卷曲的

第十七页，共82页。
单核苷酸多态性
(Single nucleotide polymorphism, SNP)
• 人类基因组计划研究结果表明，不同个体的基因99.9%是一样的，但 在序列上有极小(0.1%)的遗传差异，其中主要是 SNP。
• SNP是指在人群中出现的频率1%的先天突变。SNP存在于整个
单核苷酸多态与人类个体差异
第二十二页，共82页。
单核苷酸多态与个体疾病易感性差异
第二十三页，共82页。
研究问题 1:
Why only < 20% smokers develop lung cancer?
Genetic susceptibility? Exposure
SNPs？
Cancer
CIR by 70 yrs
M: 15.9% F: 9.5%
(Peto, BMJ, 2000)
第二十四页，共82页。
Cancer-free
Screening, prevention
研究问题 2:
Why some lung cancer patients have no response to chemotherapy?
SNPs？
第三十七页，共82页。
Affordable Highthroughput
Platform Service
Accessible Genome and Genetic
Variation database
第三十八页，共82页。
分子流行病学在疾病预防和控制中的应用
（一）病因的探讨及病因致病机制的研究
1、传染病病因及流行规律的探讨 研究已知或新发传染病的病原体和流行特点 病原学诊断（基因诊断）、基因分型 研究分布特点，传染源追踪和传播途径确定 观察病原体在体内持续时间和消长规律

pK1 = 0.9
第二磷酸基
第一磷酸基
鸟嘌呤核苷酸
核
pK2 = 3.7
苷
含氮环 pK3 = 6.1
pK1 = 0.7
第二磷酸基
酸
第一磷酸基
烯醇式羟基
离子化程度
解 离
pK2 = 4.3 含氮环
胞嘧啶核苷酸
曲 线
pK1 = 0.8 第一磷酸基
pK3 = 6.3 第二磷酸基
pK1 = 1.0 第一磷酸基
核酸的理化性质专业知识专家讲座
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4 第4页
对酸最不稳定是嘌呤与脱氧核糖之间糖苷键（嘌呤 碱） :
DNA
pH1.6, 37℃ 对水透析
无嘌呤酸
(除去嘌呤碱)
pH2.8 100℃、1hr
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5 第5页
嘧啶糖苷键水解则需要较高温度:
嘧啶糖苷键(DNA或RNA)
甲酸(98~100%) 加热
15 第15页
第二节 核酸酸碱性质
核酸碱基、核苷、核苷酸均能发生解离, 所以核酸也 就具备了可解离酸碱性质。
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16 第16页
1.碱基解离
因为嘧啶和嘌呤化合物杂环中N以及各取代基（-OH） 具结合和释放质子能力, 所以这些物质现有碱性解离又有 酸性解离。
各种碱基解离特点及其常数见书本P505
30 第30页
一、核酸变性 (denaturation)
2. 核酸变性原因:
温度升高 : 热变性 酸碱度改变: 酸碱变性
DNA测序
尿素：PAGE中惯用变性剂； 变性剂使用:
甲醛：琼脂糖凝胶电泳惯用变性剂
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一个分子或一个原子是一个系统，但不是生命系 统，因为生命系统能完成一定的生命活动，单靠一个 分子或一个原子是不可能完成生命活动的。
第三十七页，共82页。
不同的生物具有不同的具体的生命系统，这说明 了什么呢？
越高等的生物其生命系统越复杂，而低等生物 则比较简单。由此说明生命系统的复杂性和多样性 。
从最小的细胞开始，到最大的系统生物圈，尽管 生命系统复杂多样，大小不同，但它们层层相依，紧 密联系，都离不开细胞这一最基本的生命系统。
精子和卵细胞结合成为受精卵。受
精卵是新生命的开始。
人的发育其本质是细胞分裂和细
胞分化。
由此可见，多细胞的高等生物的
生殖和发育也离不开细胞。
第十八页，共82页。
实例3 缩手反射的结构基础
完成一个简单的缩手反射，至少需要哪些细 胞的参与？
感受器 效应器
传入神经
神经中枢
传出神经
第十九页，共82页。
第二十页，共82页。
实例4 艾滋病（AIDS）
病原微生物：艾滋病病毒HIV 攻击对象：免疫系统的淋巴细胞 死亡原因：淋巴细胞被大量破坏 ，导致人体免疫力降低，其他病 原微生物感染。 因此，生物体的某一种细胞受到损害，也会影响该种生 物的生命活动。
第二十一页，共82页。
除艾滋病外，你还能举出特定的细胞受到损害导致疾病 的例子吗？ 脊髓运动神经元受损，导致小儿麻 痹症以及相应肢体瘫痪。 胰岛细胞受损，导致糖尿病 大脑皮层上的听觉神经元受损可导致 听觉发生障碍。
那为什么我把这些细胞分离出来，随意混在一起却 不能够学习呢？两者的区别在哪？
各种细胞密切合作形成系统，才能共同完成一系列 复杂的生命活动。
第二十八页，共82页。
三、生命系统的结构层次

在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的 元素或分子。标记常用的为同位素标记法和生物素 标记法。
通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道 被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上 的位置，也就知道了它的分子大小。
3、 杂交 杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。
应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品〔如为双 链，那么须先变性成为单链〕结合到硝酸纤维素膜 上，然后与溶液中标记探针进行杂交。
cＤＮＡ探针不含内含子及高度重复序列，是一种较为理想的核酸探针。 因此尤其适用于基因表达的检测。
３.ＲＮＡ探针
通常采用含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体来制备高度敏感的 ＲＮＡ探针。
目的基因→克隆到含Ｔ７或ＳＰ６启动子的表达载体的多克隆 位点，用适当的限制性内切酶在插入序列下游将质粒线性化， 参加Ｔ７或ＳＰ６ ＲＮＡ聚合酶、ＮＴＰｓ和α－３２Ｐ －ｄＵＴＰ，即可以目的基因的ＤＮＡ为模板，合成高放射 性的ＲＮＡ探针。
ＲＮＡ作为探针较为理想，但极易被环境中大量存在的核酸酶降 解，较ＤＮＡ难于操作，故限制了其使用。
４.寡核苷酸探针 随着ＤＮＡ合成仪的广泛应用，采用人工合成的寡核苷酸片段作
为探针也非常普遍。
研究者可根据的基因序列或根据氨基酸序列推测出的ＤＮＡ序列， 合成一段１５－３０ｎｔ的寡核苷酸片段。
DNA探针〔包括cDNA探针〕的主要优点有下面三点：
第二节、核酸探针及其标记
• 核酸探针是指标记有放射性或其他标记物 的单链多聚核苷酸片段，用于检测核酸样 品中特定核苷酸序列。
一、探针的种类及其选择
核酸探针可以是人工合成的寡核苷酸片段，可以是克隆 的基因组DNA、全长cDNA或局部片段，也可以是 RNA。
应根据实验目的及要求不同，选择不同类型的探针。选择 探针时应充分考虑探针的特异性及其来源是否方便等因 素。

➢ 那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类 GAPDH基因片段呢？
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• 12号染色体扩增出的序列是真正的GAPDH基因。 • 在下面的序列比对中，我们可以发现，X染色体上被扩增出的序列实际上是
GAPDH的加工的假基因（processed pseudogene）。 • 因此，如果我们能保证作为模板的cDNA不混杂有染色体DNA，就可以用这一
发、精斑、口腔上皮细胞 —固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化
模板DNA的浓度： 0.1～2ug/100ul体系 —PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高 —模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加
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5、Mg2+浓度
• Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 • 在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～
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⑤引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰） — 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物5′端可修饰
— 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板
DNA 互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10
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1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶 即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。
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PCR的基本原理