T_DNA转移研究进展

转基因技术的研究综述及利弊关系转基因技术作为生命科学的前沿技术之一，已经逐渐走入了人们的生活。

转基因技术可以认为是在一定程度上通过科学技术手段让其他生物、植物朝着对人类有利方向开展的技术。

通过对转基因技术的介绍，阐述了该技术的利弊关系，指出只有通过正确的引导和规管理，才能很好地利用该技术，使它为人类效劳。

关键词转基因技术开展历程利弊关系1 前言转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。

自从人类耕种作物以来，我们的祖先就从未停顿过作物的遗传改进。

过去的几千年里农作物改进的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。

遗传学创立后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进展优良基因的重组和外源基因的导入而实现遗传改进。

因此，可以认为转基因技术是与传统技术一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进展遗传改进。

但在基因转移的围和效率上，转基因技术与传统育种技术有两点重要区别，第一，传统技术一般只能在生物种个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制；第二，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进展，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地对*个基因进展操作和选择，对后代的表现预见性较差。

而转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。

因此，转基因技术是对传统技术的开展和补充。

将两者严密结合，可相得益彰，大提高动植物品种改进的效率。

2 转基因技术的介绍转基因技术是指用人工别离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术，可分为转基因动物与转基因植物两大分支。

人们常说的"遗传工程〞、"基因工程〞、"遗传转化〞均为转基因的同义词。

2.1 转基因植物技术转基因植物是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因整合到植物的基因组中，并使其得以表达，从而获得的具有新的遗传性状的植物。

转基因抗虫棉的研究进展摘要：综述了转基因抗虫棉的研究进展，包括抗虫基因的研究、载体构建技术的研究、转化技术的研究及存在的问题等，并展望了转基因抗虫棉未来发展前景。

关键词：转基因抗虫棉花研究进展引言棉花生长周期长、虫害多，造成的损失非常严重。

据统计，在转基因抗虫棉商品化之前，全球每年用于防治棉花虫害的费用高达20亿美元，约占所有农作物防虫费用的四分之一。

[1]传统的化学农药防治棉铃虫不仅费用高，且已引发了棉虫的抗药性，同时化学杀虫剂的过量使用也带来了环境污染的问题，而转基因植物所产生的杀虫蛋白主要是通过抑制害虫消化等生理功能而达到抗虫的目的。

与施药防治棉田害虫相比，转基因技术具有较多优势：不会在土壤和地下水中造成残留；不会被雨水冲刷流失；对非靶标生物无毒性；保护作用无盲区；减少农药及用工投入[2]等。

雪花凝集素（Gulanthus nivalis agglutinin gene，GNA）是第一个转入重要作物、并对刺吸式口器害虫有抗性的基因，转GNA的水稻可降低害虫的存活率，阻止害虫的发育[3]。

另外烟草阴离子过氧化物酶[4]、昆虫几丁质酶基因[5]也被用于抗虫基因工程的研究。

迄今为止在棉花抗虫基因工程研究领域，最成功的例子是苏云金芽孢杆菌Bt杀虫基因的应用，其次是蛋白酶抑制剂基因。

另外，凝集素、α-淀粉酶抑制剂、胆固醇氧化酶等转基因抗虫植物的研究也取得了进展，所以利用基因工程技术培育转基因抗虫棉受到了各国的高度重视。

自1996年商品化种植转基因作物开始，全球转基因植物的种植面积已由1996年的170万hm2猛增到2008年的1.25亿hm2，增长了73倍，2008年全球市场价值已达75亿美元，约占全球商业种子市场的22%，其市场价值优势明显，转基因产业得到了蓬勃发展，尤其在发展中国家。

印度Bt棉2002年引入，连年种植面积快速增加，至2008年达760万hm2，产量翻番，曾经是全球棉花产量很低的国家，现已成为棉花出口国。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

T-DNA插入侧翼序列的分离方法获得T-DNA插入突变体库后，插入突变体在基因序列水平上的变化与表型变化的关系，必须通过序列分析来做进一步的研究。

通过对T-DNA插入位点侧翼序列的生物信息学分析，可以预测整合位点的基因功能，获知该基因控制的表型信息。

目前，用于分离T-DNA插入侧翼序列的方法主要有：热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR）技术（Liu和Whittier，1995）、反向PCR（Inverse PCR，IPCR）技术（Triglia等，1988；Dose等，1991）、接头PCR（Adaptor Ligation PCR）技术（Rosenthal和Jones，1990）、质粒拯救（Plasmid rescue）技术（Perucho等，1980；Grant 等，1990）和PCR步移（PCR-Walking）技术（Siebert等，1995）等。

1 TAIL-PCRTAIL-PCR技术起初被用来分离P1和YAC克隆插入末端序列（Liu和Whittier，1995），经过改进后用于分离拟南芥T–DNA插入侧翼序列（Liu等，1995）。

其基本原理是利用多个嵌套的插入序列特异性引物（Special Primer，SP）分别和较短的、Tm值较低的任意简并引物（Arbitrary Degenerate Primer，AD Primer）组合，特异引物的Tm值一般在57-62℃，AD引物的Tm值一般在44-46℃，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应使特异产物的扩增优先于非特异性产物的扩增，从而得到特异性的扩增产物。

TAIL-PCR的反应流程如图3所示，一般分为3次反应：第一次PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、10次较低特异性的反应和12次热不对称的的超级循环构成。

通过5个循环高特异性的反应，使SP1与已知的序列（载体或T-DNA）退火并延伸，提高目标序列的浓度。

拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。

关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。

T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。

，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。

同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。

借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。

由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。

由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

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农杆菌转化机理引言农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。

它通过水平基因转移的方式，将外源DNA导入到植物细胞中，并在植物细胞中稳定地整合和表达。

农杆菌转化机理的研究对于植物基因工程和农业生产具有重要意义。

本文将深入探讨农杆菌转化机理的相关内容。

农杆菌转化的基本过程农杆菌转化的基本过程可以分为以下几个步骤：1. 识别和感应农杆菌通过感受植物释放的信号物质，如植物激素和酚类物质，来识别植物细胞。

一旦识别到植物细胞，农杆菌就会感应并附着在植物表面。

2. 切伤和释放农杆菌在附着到植物表面后，通过产生细菌素酶，切伤植物细胞壁，从而释放细菌细胞外质粒（T-DNA）。

3. T-DNA传输T-DNA是农杆菌质粒中的一个片段，包含了农杆菌所携带的外源基因和调控元件。

一旦T-DNA被释放到植物细胞中，农杆菌会利用自身的转座酶将T-DNA整合到植物细胞的染色体中。

4. 基因表达和生物学效应一旦T-DNA整合到植物细胞染色体中，外源基因就可以被植物细胞转录和翻译，从而产生外源蛋白。

这些外源蛋白可以改变植物细胞的生物学过程，如激素合成、细胞分裂和生长等。

农杆菌转化机理的调控农杆菌转化机理的调控非常复杂，涉及到多个信号通路和调控因子的参与。

1. 感应和识别的调控植物激素和酚类物质在农杆菌感应和识别过程中发挥着重要作用。

激素信号通路中的激素感受器和调控因子可以调节农杆菌与植物细胞的相互作用。

2. T-DNA传输的调控T-DNA传输过程中的调控因子包括细菌素酶、转座酶和相关辅助蛋白。

这些因子可以调节T-DNA的释放、整合和稳定性。

3. 基因表达和生物学效应的调控外源基因在植物细胞中的表达和生物学效应受到植物内源基因的调控。

植物细胞中的转录因子和表观遗传修饰可以影响外源基因的转录和翻译水平。

农杆菌转化机理的应用农杆菌转化机理的研究为植物基因工程和农业生产提供了重要的理论基础和实践手段。

tdna名词解释
嘿，你知道啥是 TDNA 不？这可真不是个一般的玩意儿啊！TDNA 呢，就好比是一把钥匙，能打开基因这座神秘大门的钥匙！比如说吧，就像你有个超级大的宝库，TDNA 就是能让你进入宝库找到宝藏的关键。

它在基因工程里那可是有着至关重要的地位呀！想象一下，基因就
像是一个复杂的大拼图，而 TDNA 就是能帮我们准确找到需要那一块
的小助手。

科学家们通过它来把特定的基因片段转移到受体细胞里，
哇塞，这多神奇呀！
咱再打个比方，TDNA 就像是个引路人，带着我们走向基因的奇妙
世界。

比如说，我们想让一种植物拥有某种特别的性状，TDNA 就能
帮我们把相关的基因准确地送过去，让植物发生我们期望的改变。

“哎呀，这 TDNA 咋这么厉害呢？”你可能会这么问。

嘿嘿，它就是
这么牛啊！它能让原本不可能的事情变得可能，让我们对生物的改造
和研究变得更加深入和精确。

你看，没有 TDNA，我们怎么能实现那么多基因方面的突破和创新呢？它就像是黑暗中的一盏明灯，照亮了我们在基因领域探索的道路。

所以呀，TDNA 真的是超级重要的呀！它就是基因工程的得力小助手，没有它可不行呢！。