指示植物检测甘薯病毒方法的改进研究(固定图片)

指示植物检测甘薯病毒技术的改进研究 张希太，张彦波，肖 磊，董策，谢淑芹 （邯郸市农业科学院生物技术中心，河北邯郸 056001） 摘要：为了改进传统的指示植物法检测甘薯病毒技术，在已成功进行巴西牵牛组织培养的基础上我们开展了在试管中对巴西牵牛和甘薯试管苗茎段进行嫁接培养检测甘薯病毒的试验。发现与带病毒的甘薯试管苗茎段嫁接的巴西牵牛试管苗茎段所带的叶片均能表现出黄化、花叶等阳性反应；与无病毒的甘薯试管苗茎段嫁接的巴西牵牛试管苗茎段所带的叶片均能健康生长。经过历时5年对369个样本的检测试验，“甘薯、巴西牵牛试管苗嫁接法”和传统检测法对各个样本的检测结果完全一致。“甘薯、巴西牵牛试管苗嫁接法”可以替代传统的“巴西牵牛种子苗网室嫁接检测法”检测甘薯组培苗是否带有病毒。是一种操作简单，一般脱毒甘薯组培苗生产单位可为，灵敏度高，成本低，不受季节性和环境影响的新检测方法。

关键词：指示植物；巴西牵牛；检测；甘薯，病毒 Study on Improve the Technology that Test the Viruses in Test-tube Plantlets of Sweet Potato by indicator plant Zhang Xitai, Zhang Yanbo, Xiao Lei, Dong Ce，Xie Shuqin (Handan Biotechnology Center of Agrocniture Research Institute, Handan 056001, Hebei, China) Abstract: In order to improve the conventional detection technologies testing viruses in test-tube plantlets of sweet potato using the indicator plant（Ipomoea Setosa），We have done the experiments grafting the test-tube plantlets of sweet potato and Ipomoea setosa and cultured in vitro for testing viruses in test-tube plantlets of sweet potato based on successful tissue culture technique of Ipomoea Setosa. We have done found the leaves of the test-tube plantlets of Ipomoea setosa that grafting with the test-tube plantlets of sweet potato infected by the virus become yellowing or floral leaf. The test-tube plantlets of ipomoea setosa that grafting with the test-tube plantlets of sweet potato no virus infection can normal growth. We have been get the Completely consistent test results use the two methods that “graft the test-tube plantlets of sweet potato and Ipomoea setosa and cultured in vitro”and“Grafted the plantlets of Sweet Potato and the Seed seedling of ipomoea setosa in net room”to test 369 samples in the past 5years.The method grafting the test-tube plantlets of sweet potato and Ipomoea setosa and cultured in vitro can displace the conventional methods that “Grafted the plantlets of Sweet Potato and the Seed seedling of ipomoea setosa in net room”. It has the advantages of high sensitivity, low cost, easily controlled culture conditions, not limited by season, not affected by the external environment, etc.

Keyword：Indicator plant ；Ipomoea Setosa；Detection；Sweet Potato；Viruses

【本研究的重要意义】 病毒病是导致甘薯产量降低和种性退化的主要病害之一，在世界各甘薯种植区都普遍发生。在我国甘薯病毒病的发生非常普遍，据山东、江苏、安徽、北京等省市的调查，发病率可达60%～90%，在一些品种上发病率可达100%，由病毒病造成的甘薯产量损失一般达20%～30%，严重的可达50%以上。已成为甘薯生产的限制因子之一[1-3]。 甘薯是无性繁殖作物，一旦染病病毒就会在甘薯体内不断增殖积累，通过种薯或秧苗世代相传，对甘薯生产造成的危害逐代加重。目前对甘薯病毒病尚无有效的化学防治药剂，又没有抗病毒病的甘薯品种。唯一有效的方法是利用茎尖分生组织培养，培育脱毒甘薯在生产上推广应用[1,4]。因此快速有效的甘薯脱毒技术和准确灵敏简单易操作易推广的甘薯病毒检测方法是培育甘薯脱毒苗的技术关键。【前人的研究进展】随着生物科学的发展，特别是病毒免疫学和分子生物学技术的发展诞生了多种甘薯病毒检测方法。[5-6]最古老传统的检测方法是目测法，本方法无需仪器设备和化学药品，但是容易和别的病害症状混淆，无法辨别潜隐性病毒的侵染[1,6]。后来又出现了指示植物法，具体操作为：在防虫网室中播种指示植物巴西牵牛的种子并将待检测的甘薯试管苗进行驯化移栽，利用巴西牵牛的种子苗和待检甘薯苗进行嫁接，通过观察巴西牵牛新生叶片的发病症状来判断病毒的有无。本方法的优点为：灵敏度极高，对所有的甘薯病毒都很敏感。缺点是：需要庞大的网室和大量的生长一致的巴西牵牛种子苗。巴西牵牛种子的休眠期较长，休眠结束时间不一至，播种后发芽率很低，出苗时间有早有晚，所以很难一次性得到大批生长一致的苗子，病毒检测受季节性限制，结果受环境影响大[5-13]。现在广泛应用的检测技术有两种。首先是免疫学方法（即ELISA）本方法需要制备抗血清，而且一次只能检测一种病毒。存在以下缺点，使用的抗血清价格昂贵，检测病毒的种类高度专一，灵敏度较低，当被检植株的病毒含量很低时不能被检出，操作复杂[5-9,11-16]，非一般的生产单位所能为。目前最新的检测方法是分子生物学检测方法（PCR法），即针对某种特定的病毒的核算序列设计特定的引物，检测病毒时 首先提取病毒的DNA或RNA，然后用设计的特定引物对病毒的核酸进行PCR扩增，然后对PCR产物进行电泳，若有该引物针对的病毒核酸特有的条带即为阳性，若无该引物针对的病毒核酸特有的条带即为阴性。该方法的优点是灵敏度较高，缺点是检测病毒的种类高度专一，需要昂贵的仪器设备和药品，操作复杂[17-19]，非一般的生产单位所能为。【本研究的切入点】综合分析以上各检测方法的特点，唯有指示植物法的灵敏度最高，检测病毒的种类全面，易操作，成本低，一般的生产单位能为。因此指示植物检测法是甘薯病毒检测中最常用最可靠的方法。我研究室已成功的开展了指示植物巴西牵牛的组织培养与试管苗快繁技术研究[10]，很好地克服了巴西牵牛种子成苗难的缺点。如果能在试管中对巴西牵牛和甘薯的试管苗进行嫁接来检测甘薯试管苗病毒，那将克服了传统指示植物检测法需要庞大的网室，受季节性限制，检测结果受环境影响大等缺点将成为一种前所未有的新方法。因此我们开展了巴西牵牛和甘薯试管苗的试管微嫁接检测甘薯病毒技术进行研究。

1 材料与方法 1.1 试验时间与地点 2008—2012年在邯郸市农业科学院生物技术实验室及温室和网室中进行试验。 1.2 试验材料 巴西牵牛种子（上一年越冬前收获种子），待检测的甘薯试管苗（由郸市农业科学院生物技术试验室收集各地的薯块，发芽后通过茎尖生长点组织培养繁殖而来），防虫网室由本研究室自建。 1.3 培养基 巴西牵牛种子萌发培养基MS0、MS+GA3 2.0 mg/L；巴西牵牛茎尖启动与继代培养基：MS0、MS+IBA 0.2 mg/L[10]；检测病毒时巴西牵牛茎段扦插培养基MS0。培养基制备后，均经121℃，1.52×105 Pa压力灭菌20 min备用。 1.4 试验方法 1.4.1 巴西牵牛试管苗的组织培养法 在超净工作台上将巴西牵牛种子，用0.1%的升汞（加入2滴吐温-20）灭菌20 min，再用无菌水反复冲洗6~10遍，接种到种子萌发培养基上，置于25℃的培养室中培养。种子发芽前进行暗培养，种子发芽后每天进行2000 lx的光照10 h，培养7天后，在超净工作台上，用无菌的剪刀、镊子剪掉子叶，然后切取0.5 cm长的茎尖接种到茎尖启动培养基上，每瓶接种1个茎尖，置于25℃每天进行2000 lx光照10 h的条件下培养。待茎尖生长成健壮的巴西牵牛试管植株后，剪成单茎节段，将单茎节段斜插入继代培养基上腋芽位于培养基表面进行扩繁[10]。

图1.通过腋芽再生途径繁殖的巴西牵牛试管苗 Figure 1.The breeding test-tube plantlets of Ipomoea setosa by Axillary buds regenerated plants

1.4.2 甘薯和巴西牵牛试管苗的嫁接方法 在超净工作台上，于经过灭菌的培养皿中，将巴西牵牛试管苗和待检测的甘薯试管苗的单茎节段或双茎节段主茎的一侧用经过灭菌的锋利的刀片削去部分表皮和组织形成创口，然后将巴西牵牛试管苗和待检测的甘薯试管苗的茎段的创口部分向贴，用经过灭菌的塑料环（小移液枪头切段）将两茎段紧紧固定在一起，插入经过灭菌的不含任何激素的MS0培养基中，在26~32℃每天2000 lx光照10 h的条件下培养7~15天后，观察巴西牵牛试管苗茎段所带叶片的症状，以未进行嫁接的巴西牵牛试管苗叶片和嫁接甘薯无病毒苗茎段的巴西牵牛试管苗叶片为对照。每个检测样本至少做3个重复。3个重复中只要有1个巴西牵牛嫁接苗茎段所带叶片和对照相比出现明显的叶片黄化、花叶等症状者即为阳性（带毒）。每个样本嫁接完后更换所有用具或用酒精灼烧后再用于下一样本的操作。