植物病毒检测技术研究进展
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植物病毒生物学研究进展近年来,随着生物学领域的发展和技术的不断进步,越来越多的学者开始关注植物病毒生物学的研究。
植物病毒作为一类重要的病原体,对农业生产和植物健康造成了严重威胁。
因此,深入研究植物病毒的生物学特性,探索其传播和病理机制,对保障我国粮食安全和推动生物农业等方面都有着重要的意义。
一、植物病毒的结构和特性植物病毒是一种非细胞自我复制机体,其基本结构由核酸和蛋白质组成。
一般来说,植物病毒有两种基本类型,一种是立体结构,也就是有外层蛋白质壳的病毒,如烟草花叶病毒、西瓜花叶驳斑病毒等;另一种是无壳病毒,没有蛋白质壳包裹的病毒,如花叶病毒、谷潼花叶病毒等。
植物病毒与动物病毒有所不同,其寄主是植物,主要通过三种方式传播:介体传播、接触传播和昆虫传播。
二、植物病毒的传播和病理机制介体传播是植物病毒传播的一种主要方式,指的是通过介体将病毒传播到另一寄主上。
介体包括种子、器官、虫口、咀嚼式口器等。
接触传播是指在植物之间接触传播病毒,如擦拭、接触等。
昆虫传播则是指植物病毒通过昆虫进行传播,由于昆虫活动范围广,速度快,因此昆虫传播成为了植物病毒传播的主要方式。
植物病毒对植物的影响多种多样,不同种类的病毒可能对植物的不同组织和器官造成不同的损害,典型的病症如变形、变色、坏死等。
病毒感染植物后,它会主导植物产生一系列的反应,例如改变植物的形态和生理特征,抑制植物免疫系统的功能,进一步使植物易感病。
三、植物病毒的检测和控制早期的检测方法多通过观察病毒在宿主植物上的症状、利用病毒晶体和电镜等技术诊断,虽然能够达到一定程度的检测效果,但是极易出现误诊、漏诊等问题。
现代的植物病毒检测技术已经获得了很大的进展,如逆转录聚合酶链反应、实时荧光PCR、微纳米分析技术、测序技术等,这些新技术具有检测快速、准确、灵敏度高等优点。
同时,控制植物病毒的方法也有很多,包括早期防治、农业生产管理和生物技术措施。
早期防治主要包括发现病毒早、尽早制定措施、预防感染扩散等,农业生产管理则是通过有机肥料、合理施肥、病虫害预防等方式来控制病毒的感染。
植物病毒病检测及防治的研究进展摘要:植物病毒病又称植物癌,给农作物及经济作物带来了严重危害,降低了农作物产量和质量,每年仅在我国因病毒感染农作物造成的损失就可达200亿美元,植物病毒病造成的损失是世界人口生存的威胁之一。
关键词:植物病毒病;检测;防治一、植物病毒病的检测技术病毒有两种,以DNA为遗传物质的病毒称为DNA病毒,以RNA为遗传物质的病毒称为RNA病毒,90%的植物病毒是RNA病毒。
早期RNA植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法(指示植物检测法),即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式,将待测带毒植株汁液接种到一株或多株指示植物上,从而观察其在指示植物上的症状。
指示植物是对某一种或某几种病毒和类病毒敏感的植物,感染后可迅速出现明显症状。
传统生物学方法鉴定谱广,操作简单,但需培育大量指示植物,检测速度慢,易受外界环境影响。
随着电子显微镜的出现,病毒的真实形态才得以展现。
电子显微镜观察结果直观、准确,还能观察病毒引起的寄主细胞病变及内含体特征,是深入研究病毒病机理的重要手段之一。
但仪器设备昂贵,制片及操作技术复杂,难以掌握,对操作人员技术水平要求高。
由于每一种植物病毒产生的抗血清各有特性,人们研发一种利用抗原抗体外特异性免疫反应检测植物病毒的方法。
酶联免疫吸附法(ELISA)是通过酶催化颜色反应将抗原抗体结合起来的一种方法,其具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、成本低等优点,可用于大规模样品检测,是血清学中应用最广泛的方法,已成为检测植物病毒的关键技术。
随着生物体遗传物质研究的逐步深入,人们发现通过核酸能准确、快速地鉴定植物、动物和微生物的物种和种群。
基于核酸检测的分子生物学方法比血清学方法具有更宽的检测范围、更高的灵敏度、更强的特异性,适用于大批量样本检测,在植物病毒检测中得到了迅速而广泛的应用。
包括核酸杂交技术(Nucleic acid hybridiza-tion)、反转录PCR技术(RT-PCR)、荧光定量PCR技术(real-timePCR)、DNA微阵列技术(DNA microarray)。
植物病虫害识别新进展在我国,植物病虫害对农业生产和生态环境造成了巨大的损失。
据统计,每年因植物病虫害造成的农业经济损失高达数百亿元。
因此,研究和推广新的病虫害识别技术,提高病虫害防治效果,降低经济损失,已成为当务之急。
一、遥感技术在植物病虫害识别中的应用遥感技术是一种非接触式、远距离的监测技术,可以通过对植物生长状况、生理特性等进行监测,从而实现对病虫害的早期识别。
目前,遥感技术在我国已取得了显著的成果,如:卫星遥感、无人机遥感等。
1. 卫星遥感技术卫星遥感技术利用高分辨率遥感影像,通过对植物冠层结构、叶面积指数、色素含量等参数的监测,可以准确判断植物病虫害的发生和发展趋势。
卫星遥感技术还可以实现大范围、同步的病虫害监测,为政府决策提供科学依据。
2. 无人机遥感技术二、生物识别技术在植物病虫害识别中的应用生物识别技术是利用生物体的生理、形态、遗传等信息,对病虫害进行识别的一种技术。
近年来,生物识别技术在植物病虫害识别领域得到了广泛应用。
1. 遗传特征识别技术遗传特征识别技术主要通过对病原菌的DNA、RNA等进行提取和分析,从而实现对病原菌的快速识别。
还可以利用基因芯片等技术,对植物体内的抗病基因进行检测,从而评估植物的抗病能力。
2. 免疫识别技术免疫识别技术是利用抗原、抗体之间的特异性反应,对病虫害进行识别。
通过制备特异性抗体,可以制备出相应的抗体检测试剂盒,实现对病原菌、病毒等的快速检测。
1. 深度学习技术2. 支持向量机技术支持向量机技术是一种基于统计学习理论的方法,通过对训练样本进行分类,可以得到一个最优的分类器,实现对病虫害的识别。
支持向量机技术在处理小样本、高维数据等方面具有优势。
一、遥感技术在植物病虫害识别中的应用遥感技术在植物病虫害识别中的应用,为我国农业提供了强大的技术支持。
其通过监测植物的生长状况、生理特性等参数,实现对病虫害的早期识别。
目前,遥感技术在我国已取得了显著的成果,其中包括卫星遥感技术和无人机遥感技术。
植物病毒分类状况研究进展裴茂松摘要:本文介绍了国际病毒分类委员会九次关于植物病毒病分类状况的报告,并根据第九次报告列出了最新的分类系统。
关键词:植物病毒;国际病毒分类委员会Recent adcance of the universal system of plant virus taxonoxyPei MaosongAbstract:This paper introduces the classification of plant virus disease according to nine reports ofICTV(International Committee on Taxonomy of viruses), and gives the latest classification system.Key words: plant virus;ICTV国际病毒分类系统是一个迅速发展和正在完善的系统,国际病毒分类委员会(ICTV)每次报告都会出现较大变化,现将ICTV九次报告公布的病毒分类情况进行简述。
1.植物病毒病分类情况1966年,在莫斯科举行的国际微生物学代表会议上,成立了国际病毒命名委员会( International Committee on Nomenclature of viruses,简称ICNV ),当时在植物病毒分类系统中承认了Branoes的六个组。
1975年,于马德里召开了国际病毒分类委员会(International C ommittee on Taxonomy of viruses简称ICTV,即由ICNV改为ICTV ) ,第二届会议,Feenner(澳)根据ICTV第二届会议的报告于1976年出版了《植物病毒分类与命名》一书[1],介绍了病毒的27科71属(组)的名称,其中包括植物病毒的2个科20个组。
1978年9月于海牙召开第三届国际病毒分类委员会(ICTV)会议,Matthews(新西兰)报告[2],将350个种子植物病毒成员分别隶属于5大类群2个科23个组。
植物病毒学的研究与应用前言植物病毒学是农业生产中的重要领域,其研究对象是影响植物生长、生殖和产量的病毒。
这些病毒不仅会造成植物生长发育异常,而且也会影响人们的生活。
为了保障农业生产和人们的生活,植物病毒学研究和应用显得尤为重要。
一、植物病毒感染的危害植物病毒感染会导致植物体内生物化学代谢异常,引起植物出现形态异常、生长迟缓、气孔关闭不利于光合作用以及产量下降等问题,严重影响植物的生存和生长发展。
一些植物病毒还能通过嫁接和传播等手段,不断地扩大传染范围,导致农作物死亡,造成严重的经济损失。
另外,在全球化的今天,一些新的病毒疫情也出现了,如现今在全球范围内大行其道的新冠疫情,以及近年来在中国北方高发的“羊婆病毒”等疫情都是通过人、动物和植物之间的互动传播的,因此,植物病毒学的研究与应用显得尤为重要。
二、植物病毒的传播途径植物病毒的传播途径主要有四种,分别是虫媒传播、种子传播、物理传播和嫁接。
其中虫媒传播是植物病毒传播的最主要方式,包括昆虫、螨和蚜虫等昆虫动物,这些昆虫一般是以植物花蜜为食,又被称为食蜜昆虫,其传播的速度非常快,范围也十分广泛。
而种子和胚乳是另一种植物病毒传播途径,通过种子和胚乳传播的病毒数目较少,但其影响也相对较小。
物理传播是指利用人为手段传播病毒,如接种、切割和几何传播等。
嫁接是植物病毒最常见的传播方式,主要是将病毒感染的组织接种到未感染的健康植物上,使其继续感染和传播。
三、植物病毒的检测和诊断植物病毒的检测和诊断是关键一环,为了保障农业生产和防控疫情的蔓延,及时准确地检测和诊断病毒是至关重要的。
当前,植物病毒的检测技术已经非常成熟,主要方法有免疫学检测、分子生物学检测和传统生物学检测三种。
其中,免疫学检测主要是利用生物化学和免疫学技术来检测植物病毒,常用的有ELISA、免疫荧光法、西方印迹法等。
分子生物学检测是最新的检测技术,主要是利用PCR、实时荧光PCR和DNA芯片等技术来检测病毒。
植物学领域中的分子生物学技术研究进展随着生物科技的发展,分子生物学技术在植物学领域的研究中发挥着越来越重要的作用。
这些技术包括PCR扩增、DNA测序、基因编辑等,已经成为植物学家们进行基因工程、病毒防治、植物进化等领域研究的必备工具。
本文将介绍一些植物学分子生物学技术研究的进展。
1. PCR扩增技术PCR扩增技术(聚合酶链式反应)是一种基于DNA聚合酶的体外DNA复制技术,它能够从极低浓度的DNA样品中扩增出足够多的DNA,在植物学领域中特别用于基因检测和检验。
PCR扩增技术通过特异性引物的作用,在核酸模板上选择性地扩增特定的DNA片段,从而实现了DNA的快速、准确的大量制备。
它不但可以用于检测和诊断植物病毒、真菌病、细菌病等植物疾病,还可以用来研究植物遗传多样性、物种分类学、演化等问题。
2. DNA测序技术DNA测序技术是指将DNA序列读取出来并将其转化为可读的数字或字母序列。
在DNA测序技术的发展过程中,先后出现了Sanger测序、454测序、Solexa测序和Ion Torrent测序等技术。
这些技术的出现,极大地加速了DNA基因组学、遗传学以及生命科学的研究。
在植物领域,DNA测序技术广泛应用于新物种发现、植物进化和多样性分析等研究方面,为植物学的发展注入了新的动力。
3. 基因编辑技术随着分子生物学技术的不断进步,基因编辑技术已经成为植物学研究的重要方向之一。
基因编辑技术是指直接修改生物体内的基因结构或功能,通过修改基因来改变植物的性状、增强植物自身的抗逆能力或农业生产能力。
在植物遗传改良研究中,利用基因编辑技术可以快速精准地实现目标基因的删减和编辑,从而达到设计和篡改特定基因序列的目的。
这一技术的应用范围非常广泛,可以用于研究植物生长和发育、植物抗逆性等多个领域。
4. 单细胞RNA测序技术单细胞RNA测序技术是运用流式细胞术、芯片技术、PCR扩增和高通量测序等技术,对单个细胞进行基因表达水平的测量和分析。
植物病毒研究所植物病毒是一种严重威胁农作物生产的病原体,对于现代农业生产具有重要意义。
植物病毒研究所是致力于研究植物病毒特性、传播途径及防控措施的机构。
本文将介绍植物病毒研究所的组织架构、主要研究内容以及未来发展方向。
组织架构植物病毒研究所下设多个研究组,每个研究组关注不同类型的植物病毒及其相关研究领域。
核心团队包括病毒学专家、植物学专家、分子生物学专家等,共同开展研究工作。
此外,研究所还设有实验室、种植基地等科研条件支持设施,为研究人员提供必要的实验环境。
主要研究内容植物病毒研究所的主要研究内容包括:1.植物病毒鉴定与检测:通过传统和现代检测技术,对不同病原体进行鉴定和检测,确立感染植物的病毒种类。
2.病毒传播途径研究:探究不同植物病毒的传播途径,包括昆虫传播、接种传播等,为制定防控策略提供理论依据。
3.病毒与宿主相互作用:研究植物病毒与植物宿主之间的相互作用机制,探寻宿主的抗病机制,为培育抗病品种提供科学依据。
4.病毒防控技术的研究:开发新型的植物病毒防控技术,包括抗病毒转基因技术、病毒防控药剂研发等,提高农作物产量和质量。
未来发展方向植物病毒研究所将继续深入开展以下工作:1.跨学科研究:加强与相关学科的合作,拓展研究领域,提高研究水平。
2.技术创新:不断引进新技术,提高研究所的科研能力和竞争力。
3.人才培养:加强研究团队建设,培养一支高水平的科研团队,为植物病毒防控提供坚实人才支撑。
植物病毒研究所致力于推动植物病毒领域的研究发展,希望通过持续努力,为农业生产提供更好的科学支持。
以上是对植物病毒研究所的简要介绍,希望对读者理解该机构的重要性和研究方向有所帮助。
植物病害的诊断与防治技术研究植物病害是农业生产中的一大难题,它们会导致作物产量下降甚至死亡。
因此,我们必须加强对植物病害的诊断和防治技术的研究,以保障粮食安全和农业可持续发展。
一、植物病害的诊断方法1. 病原鉴定通过对引起植物病害的病原体进行鉴定,可以准确诊断病害类型并制定相应的防治措施。
常用的鉴定方法有生理和生化特性鉴定、形态学鉴定、分子生物学鉴定等。
2. 病害症状观察植物病害的症状多种多样,观察病害部位、形态、颜色、纹理等方面的变化,可以快速判断病害类型。
同时结合病害发生的环境条件、作物生态环境等因素也能提供诊断依据。
3. 病原检测利用现代技术检测 diseased tissues 中的DNA或蛋白质分析细菌、真菌和病毒的特征,是一种准确快速的检测病原的方法。
此外,病原检测还包括病原学的深度分析,也就是了解病毒或细菌的传播方式、生命周期、菌株、基因和病毒衍变等。
二、植物病害的防治技术1. 防治技术的分类(1)生物防治技术:通过使用天敌或有益微生物来控制植物病毒的生长和繁殖。
(2)物理防治技术:如建立遮光网、调整温湿度等改善植物生长环境。
(3)化学防治技术:通过使用杀虫剂、杀菌剂等来控制病虫害。
但该方法有可能导致环境污染,同时也会对作物和人类健康造成潜在风险。
(4)遗传防治技术:通过转基因技术,培育抗病性强的作物品种。
2. 防治技术应用实例目前,我国在植物病害防治方面采用了较为广泛的防治技术,以下这些具有代表性的技术可以证明这一点:(1)化学防治技术:如天蚕土豆叶片枯萎病防治,可采用50%百菌清、75%美多环素、5.5%克普菌素等杀菌剂控制。
(2)生物防治技术:如黄瓜霜霉病防治,使用Trichoderma harzianum或Bacillus subtilis等微生物来控制霜霉病的繁殖。
(3)物理防治技术:如智能生长调控系统,采用先进技术调整温湿度等因素,利用光照、CO2、水分和温度等因素控制植物的生长和发育。
植物病毒学研究进展
植物病毒学是现代植物病理学中一个重要领域,研究植物病毒的特征、传播途径、防控措施以及对植物生长发育的影响。
近年来,植物病毒学研究取得了许多进展,其中包括病毒的检测技术的提高、病毒致病机理的深入探究、抗病基因的鉴定等方面。
病毒检测技术的发展
病毒检测技术是植物病毒学研究的基础,随着PCR、实时荧光PCR、蛋白质芯
片等技术的不断提高,病毒的检测速度和准确性得到了大幅提升,为早期的病毒防控提供了可靠的技术支持。
病毒致病机理的研究
随着生物学和分子生物学技术的发展,人们对植物病毒的致病机理有了更深入
的理解。
研究发现,病毒通过改变植物基因表达调控网络,破坏植物的生长发育过程,导致病变的发生。
针对不同类型的病毒,科研人员也在探索不同的抗病机制和防控策略。
抗病基因的发现和利用
随着基因组学、转录组学和蛋白质组学的不断发展,越来越多的抗病基因被发
现并利用于植物病毒抵抗育种中。
通过转基因技术、基因编辑技术等手段,科研人员将这些抗病基因导入到作物中,提高了植物对于病毒的抗性,降低了病害的发生率。
总的来说,植物病毒学研究在技术手段、病毒致病机理和抗病基因的研究方面
都取得了重大的进展,为植物病害的防控和作物生产的发展提供了坚实的科学支持。
未来,我们可以期待在更多领域看到植物病毒学研究的更多突破,为解决当前和未来植物病害问题做出更大的贡献。
植物病毒的诊断与防治技术研究植物病毒是一种常见的病害,它可以影响作物的生长和产量。
为了保障作物的安全和高质量生产,科学家们一直致力于研究和发展植物病毒的诊断和防治技术。
一、植物病毒的诊断技术对于植物病毒的诊断,传统的方法主要是通过观察病叶的外部表现来判断是否感染了病毒。
这种方法虽然简单方便,但是结果受到环境和病害本身的影响,易受误判。
因此,现代植物病毒的诊断技术主要包括分子生物学和免疫学两种技术。
其中,分子生物学的技术主要是基于病毒核酸的检测,包括PCR和实时荧光PCR技术等。
这些技术能够准确地检测出感染植物的具体病毒类型和数量,具有快速、灵敏、特异性高的优点。
而免疫学的技术则是基于病毒抗原的检测,包括ELISA和电泳等。
这些技术虽然灵敏度低于PCR,对复杂的样品处理较为困难,但是适用于大规模样品的检测。
二、植物病毒的防治技术除了诊断技术,植物病毒的防治技术也是植物保护的重要方向。
1. 常规防治技术传统的植物病毒防治技术主要是利用化学农药灭杀害虫和病毒。
这种方法虽然比较简单易行,并且在病毒感染初期能够有效控制病害,但是长期使用会导致环境污染和农产品重金属残留,对人体健康产生潜在风险。
2. 新型防治技术随着科技的进步和人们对环保健康意识不断提高,研究人员也在不断探索新型的植物病毒防治技术,如:(1)遗传改良通过利用基因编辑技术和转基因技术,能够改良作物自身的基因,使其对于植物病毒产生抵抗能力。
(2)生物农药与传统的化学农药不同,生物农药是一种生物制剂,可以利用微生物、真菌、昆虫等天然生物原料制成,用于控制害虫和病毒。
生物农药具有无毒性、无污染、安全性高等特点,越来越受到广大农民的欢迎。
(3)物理防治利用灯光、温度、红外线等物理手段来杀灭植物病毒和害虫,无污染、环保等特点,可以作为植物病毒防治的新型选择。
总之,研究和发展植物病毒的诊断和防治技术已经成为农业发展的重要方向。
我们期待科技的不断进步和创新,能够为高品质的农作物生产提供更好的保障。
利用培育技术进行各种动植物的病毒检测方法对于动植物的病毒检测方法,近年来,人们广泛使用培育技术来加强检测的准确性和效率。
培育技术是一种将待测样品在特定条件下进行培养和繁殖的方法,通过观察培养物的变化和生长情况,可以快速检测出可能存在的病毒。
本文将探讨利用培育技术进行各种动植物的病毒检测方法,并讨论其优势和不足之处。
一、细胞培养法细胞培养法是一种常见的动植物病毒检测方法。
该方法首先从待测样品中提取细胞,并将其培养在含有适当营养物的培养基中。
经过一段时间的培养,如细胞出现异常变化,例如颜色变化、病斑等,就可以判断样品可能存在病毒。
此外,可以使用荧光染料或特定抗体进行标记,以便更准确地观察和鉴定病毒。
细胞培养法的优势在于其对病毒的敏感性较高,能够检测出数量较少的病毒。
此外,该方法还可以提供病毒的纯化和分离,为进一步的研究提供了便利。
然而,细胞培养法也存在一些限制。
首先,培养细胞需要耗费大量时间和资源。
其次,不同的病毒可能需要不同的培养条件,这增加了病毒检测的复杂性和难度。
此外,某些病毒可能无法在体外培养条件下生长,从而导致检测结果的不准确。
二、分子生物学方法分子生物学方法是一种利用DNA或RNA技术进行病毒检测的方法。
其中,PCR(聚合酶链式反应)和RT-PCR(逆向转录聚合酶链式反应)是常用的技术。
通过提取待测样品中的DNA或RNA,并利用特异性引物和聚合酶进行扩增,可以快速、准确地检测出病毒。
PCR和RT-PCR的优势在于其高度特异性和灵敏性。
相较于传统的培养方法,这些分子生物学方法可以更快速、更准确地检测出病毒。
此外,PCR还可以进行定量分析,了解病毒的浓度和变化趋势,对于防控病毒传播具有重要意义。
然而,分子生物学方法也存在一些限制。
首先,这些方法对实验操作技术要求较高,对实验条件的控制也较为苛刻。
其次,PCR和RT-PCR有可能发生假阳性或假阴性结果,需要经过进一步的验证。
此外,这些方法需要在实验室中进行,不具备现场快速检测的能力。
植物病毒检测技术研究进展刘茂炎摘要:随着现代技术的发展特别是分子技术的发展,鉴定和检测病毒的方法越来越多,也越来越精确快速。
以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定,其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的;于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。
不论怎样的方法技术,都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。
在此基础上,甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。
本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。
关键词:植物病毒;检测技术;PCR病毒在生物学上特征(如病毒的理化性质,包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等)以及在寄主上的反应(如寄主范围、症状表现、传播方式等)是对病毒最直观的认识。
常规的对植物病毒的鉴定检测方法有:生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。
生物学测定依据病毒的侵染性,观察寄主植株或其它生物的症状表现;血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础;电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同;分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。
1.生物学鉴定最直接的方法是目测法,直接观察病毒对植物的病害症状。
如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV),病害症状为叶上出现花叶症状,生长陷于不良状态,叶常呈畸形;玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。
目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。
1929年美国病毒学家霍姆斯(Holmes)用感病的植物叶片粗提液接种指示植物,2~3天后接种叶片出现圆形枯斑,枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比,能测出病毒的相对侵染力,对病毒的定性有着重要的意义,这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。
国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus,RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物,该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella),玉米是灰飞虱的桥梁寄主而非最适寄主[2],以玉米作为指示植物可以良好地鉴定RBSDV。
目前接种鉴定的方法主要有四种:粉風接种鉴定、嫁接接种鉴定、农杆菌接种鉴定、基因枪轰击法接种鉴定(叶青静等,2009)。
后两种鉴定方法涉及到了分子克隆技术,是传统方法与基因工程技术的结合。
用农杆菌接种法将番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus disease, TYLCD )导入叶盘和整个植株,TYLCV 在植株中进行系统侵染,诱导致病症状,同时此法还可以用来筛选抗TYLCV的植株[3]。
2. 免疫-血清检测方法2.1.血清学检测法目前血清学技术依然是植物病毒病原检测中最常用的方法之一,它是上世纪世纪六七十年代诞生的病毒检测技术,此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为核蛋白的特性而设计的,利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体,从而进行病毒的定性定量分析。
其中重要的一些方法有:补体结合测定法(补体能在抗体存在的情况下通过补体的酶作用溶解红细胞和革兰氏阴性菌)、沉淀法(不同病毒类型在电解质存在时抗体与同源抗原相互结合形成的沉淀也不同)等。
利用基因工程的方法从大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中高效表达病毒的外壳蛋白,纯化表达产物制备抗血清具有特异性强的特点,可弥补常规方法的不足[4]。
2.2.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附实验(ELISA)也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理,只是在抗体上附带了酶标记,从而使反应可以有颜色强弱的变化,利于定时定量监测病毒浓度。
此法灵敏度高,且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰。
ELISA基本类型主要有间接法(I-ELISA)和直接法(DAS-ELISA也叫双抗体夹心ELISA)[5]、三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)等(Accotto et al., 2000; Accotto&Noris, 2007;孙伟等,2002)。
其中TAS-ELISA是检测TYLCV常用和有效的手段之一。
1976 年Voller等首次将ELISA 方法用于检测植物病毒,Clark 和Adams 等[6]在1977年首次对植物病毒病原利用酶联免疫法进行了鉴定。
ELISA 方法可以检测出0.1~10 ng/mL 的病毒,特异性很强、操作简单、简便有效,国内外已研发出许多商品化的ELISA 试剂盒[7-10]。
因此,在植物病毒检测中ELISA技术也广泛地应用于病毒病的鉴定和进出口检疫上。
这种酶联免疫吸附测定(ELISA)是结合了酶的高效催化作用和抗原抗体的免疫反应,酶与抗体通过化学方法相结合而形成酶标抗体,酶标记抗体直接与包被在固体支持物上的待测抗原或抗体特异性结合或通过免疫桥特异性结合,再在酶的作用下使底物产生有颜色或高电子密度的可溶性产物,结果通过肉眼或比色法来进行定性的测定,从而得到抗体的性质和数量。
2.3.基于酶联免疫吸附法的新技术2.3.1组织印迹法此方法包括斑点免疫结合测定法(DIBA-ELISA 或dot-ELISA)、直接组织斑点免疫测定(IDDTB-ELISA)等[11]。
这些技术直接将组织印迹在膜上, 不仅保持了ELISA 的灵敏性和特异性等特点, 而且简化了操作程序, 使病毒检测更加快速、简单、方便, 且印迹在硝酸纤维膜上的样品保存时间较长, 检测结果能直观地显示出病毒感染的部位, 适用于植物病毒的大规模普查。
2.3.2免疫毛细管区带电泳技术免疫技术与电泳技术结合发展出了免疫毛细管区带电泳技术(Immuno Capillary Zone Electrophoresis,I- CZE)。
I-CZE 将血清学反应的专化性和毛细管区带电泳的灵敏、快速、可自动检测等特点结合起来, 实时检测抗原-抗体复合体,I-CZE 可快速分析多个样品, 因而在苗木带毒检测、植物检疫等方面可发挥巨大作用, 有广阔的应用前景。
2.3.3免疫PCR技术免疫技术与PCR 技术结合发展出了免疫PCR技术(I-PCR 或IC-PCR)。
免疫PCR 是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR 的高灵敏度有机结合的检测技术。
该技术先用抗体来捕获病毒, 提取核酸后, 再进行PCR 或RT-PCR 检测。
将PCR 技术和抗原抗体反应相结合,灵敏性非常高。
因其对一个分子的抗原都可以进行检测而具有十分广泛的应用前景,是一种用于检测微量抗原的PCR 技术。
该方法由于能去除抑制物质而改善检测环境, 比标准PCR 方法更为灵敏、可靠。
G. Harper 应用IC-PCR 检测到香蕉条纹病毒[12]。
此外还有快速免疫滤纸法、免疫胶体金技术、免疫沉淀法、免疫电镜、荧光免疫、放射免疫和Ig 指示试纸法等[13]。
3.显微成像技术病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。
对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒,可直接从感染组织或分泌液,或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查,直接观察病毒粒子。
目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能够诊断和鉴别植物病毒, 一般可诊断到属的水平。
在植物病毒的诊断和形态鉴别中, 最有用的特征是病毒粒子的形态结构和寄主病变, 有些细胞病变特征还能用于区分不同的病毒种甚至株系。
3.1超薄切片法和负染法超薄切片法其优点是可观察病毒形态和形态发生过程,缺点是操作复杂,费时,但标本可长时间保存;负染法是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度,使样品显示负的反差,衬托出样品的形态和大小,其优点是快速简易(10-20min)、分辨率高,缺点是敏感性低,要求病毒量在107以上,且所有样品应处于悬浮状态;T. Hatta 等用负染和超薄切片电镜观察区分了CMV 的6 个不同株系[14]。
3.2免疫吸附电镜技术1973 年, K.S. Derrick把电镜与免疫学技术结合, 发明了更为灵敏的免疫吸附电镜技术, 该技术现已成为植物病毒研究的一个重要手段[15]。
免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物,在电镜制样过程中病毒颗粒不能集中的沉积在有效的电镜视野内,而容易造成电镜观察时的疏漏,免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和性与吸附性的这一特点,在电镜制样过程中,于铜网上先铺展一层细胞色素A,稍后再添加一滴抗体,多余液滴用滤纸吸掉,最后点上一滴抗原和染液,由于细胞色素A的作用,减少了样品即抗体、抗原的表面能力,能形成均匀的涂层,再加抗体、抗原的吸附作用使病毒能较集中地沉集在有效视野内,从而便于电镜下的观察,大大提高了检测几率。
D. Louro 等于1984 年在此基础上建立了悬浮样品的胶体金标记免疫修饰法[16](也就是上述第二点免疫法中的免疫胶体金技术)。
此方法利用一抗对病毒进行免疫修饰, 再用胶体金标记二抗或蛋白 A 处理, 形成病毒" 抗体" 金颗粒免疫复合物。
由于在病毒表面的抗体“晕圈”上结合了直径5~10 nm 的金颗粒, 该复合物的电镜下的可见性好, 比单纯免疫修饰法更易判断。
3.3低温电镜技术以及一些局限性显微检测技术低温电镜技术,结合了电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术,其不但有分辨率高的优点,而且对病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小,常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测[17]。
X-射线衍射技术,通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构,但为了保证衍射图像的准确性,往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高,所以这种技术的使用范围相对受限。
核磁共振技术,对比前面提到的技术对操作的要求更低,运用范围也更广,但是对结构的准确性判断略低。
此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究。
4.分子生物学检测方法寄生于宿主细胞的病毒有不同于宿主细胞的特异基因组序列,这是病毒的存在的证明。
分子生物学检测法就是通过检测病毒核酸(DNA、RNA)来鉴定病毒的存在,由于是建立在核酸水平上,所以相对于血清学检测法有更高的灵敏度(Piccotbetal, 1999),并且有更强的特异性,更广的检测范围,还可以进行大批量的样本检测,甚至可以使用粗提液检测病毒。
在植物病毒鉴定检测方面, 目前应用的分子生物学技术主要有核酸斑点杂交(Nucleic Acid Spot Hy-bridization, NASH)技术、多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术、dsRNA 电泳技术等[18]。
4.1.核酸分子杂交技术(Nucleic Acid Hybridization)核酸分子杂交技术是20 世纪70 年代发展起来的,它是以DNA 分子碱基互补配为理论依据,与待测样品的DNA 或RNA 用特异性的核酸探针形成杂交分子[19-20]。