海马神经元培养

胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定【关键词】胎鼠海马神经元；体外原代培养；鉴定doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.568 文章编号：1004-7484（2013）-06-3323-02在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。

海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。

对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。

我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。

1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天sd大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：scxk（沪）2012-0002。

1.2 主要仪器与试剂 co2培养箱（thermo公司），倒置相差显微镜为（olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为zeiss lsm710，小鼠抗大鼠classⅲβ-tubulin单抗（beyotime公司），nse免疫组化染色试剂盒、dab显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），b27添加剂、neuralbasal、hoechst 33342sigma公司），dmem（高糖型）培养基、胎牛血清（gibco公司）。

1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含dmem 的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm 大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%co2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%fbs的dmem液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。

-94- Clinical Journal of Chinese Medicine 2011 V ol.(3) No.19家尤昭玲[3]治疗先兆流产时亦主张补肾健脾宁心，宁心之品多选用苎麻根、莲子心。

苎麻根甘咸入心，能布散其光明，而不为郁热，此安胎良药也。

莲子心味甘涩，性平，入心、脾、肾经，具有补脾益肾、养心安神的功效，还能收敛浮躁的心火，让人宁静且容易入睡。

正如《女科集略》云：“受妊之后，宜令镇静，则血气安和。

”又如《竹林寺女科秘要》所云：“胎气宜清不宜热，宜静不宜动。

”先贤所论安胎诸法，悉从其亲身实践总结而来，然如景岳所说：“胎气不安，证本非一，治亦不同。

……去其所病，便是安胎之法。

”同时又指出：“安胎之方不可执，当随证、随经、因其病而药之，乃为至善。

”参考文献：[1]盛爱华,黄爱武.健脾补肾法配合黄体酮治疗先兆流产80例[J].浙江中医杂志,2007,42( 11):644[2]夏桂成.中医妇科理论与实践[M].北京:人民卫生出版社,2003:308-312[3]付灵梅,尤昭玲,陈宗光.补肾健脾宁心方治疗脾肾亏虚型先兆流产30 例中国实验方剂学杂志[J].2011,17(2):232~234作者简介：冯光荣（1979-），女，河南郑州人，郑州市妇幼保健院副主任中医师，博士，主要研究方向不孕症的治疗。

编号：EA-11071239（修回：2011-10-11）乳鼠海马神经元细胞元代培养及AD损伤模型制备 Hippocampus neurons primary cultured and the AD cell model established姜海英杨进刘涛（南京中医药大学基础医学院，江苏南京，210029）中图分类号：R574.62文献标识码：A 文章编号：1674-7860（2011）19-0094-02【摘要】采用乳鼠海马做神经元细胞的原代培养和鉴定，并利用Аβ25-3损伤处理细胞，制备ＡＤ损伤细胞模型，为后继研究中药脑脊液和血清对神经元保护试验的奠定前期基础。

海马神经元细胞免疫荧光检验神经元鉴定：一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。

二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示：培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。

一、烯醇化酶鉴定：培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS 漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。

【实验趣谈】我与海马神经元的爱恨情仇之一我与海马神经元的爱恨情仇之一实验技术：流式细胞仪检测凋亡做过基础实验的老师都知道，细胞不好养，那么原代神经元的培养简直就是煎熬，从取出海马吹打消化开始，得天天捧在手心里，热了怕化了，冷了怕冻着，对神经元比对自己的孩子还好，就这样也不一定能养好！疫情时代，专门培养神经元的进口培养液一瓶难求，看着好不容易花大价钱买来的培养液源源不断的被这些宝贝嘎达吃完喝完，然后不经意的长几个突触，伸一下懒腰，发出点若隐若现的特有的神经之光时，顿时感觉神清气爽！本以为养好了细胞一切都没难度了，毕竟这祖宗都伺候好了，别的都不是事。

可是没想到做实验处理的时候更让人爱恨交加，养了8天的宝贝马上要处理了，心里那个欢喜啊，可是这一切在开了一瓶新的EBSS后彻底毁灭了，它们瞬间全部飘起，死翘翘了，一点余地都没有！我的个心脏啊，比辅导娃娃作业都难。

我太难了虽然流式细胞仪检测细胞凋亡已经成为一个比较成熟的技术，但是关于原代海马神经元的流式检测一直是一个难点。

大家都不愿意尝试，原因可能主要有两方面，一是由于原代神经元培养价格不菲，如果细胞数少，达不到到检测要求，那这批细胞就浪费了，代价太高；二是是由于原代细胞比较娇弱，消化、吹打的过程中稍有不慎就会大片死亡，影响检测结果。

笔者在历经多次血泪失败后总结了一套完整的检测步骤，成功率可达90%以上。

本文以Elabscience公司Annexin-FITC/PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒为例，具体步骤如下：一、细胞处理吸净培养液，加25%胰酶（含EDTA）消化3分钟（此为最关键步骤），以6孔培养板为例，每孔加入800ul胰酶，轻柔吹打一遍细胞（时间控制在1分钟以内），上显微镜观察，如果观察到细胞开始变圆，可继续消化1分钟，再次观察，如果大部分细胞已出现脱落，可减少消化时间，加入种植液终止消化，因为神经元是贴壁细胞，再次轻柔吹打孔内的细胞2分钟，直到细胞全部脱落，离心机离心（1000转，3分钟）二、洗涤离心后吸净上清，加入适量PBS轻柔吹打细胞，混匀后再次离心（1000转，3分钟）三、染色离心后吸净上清，加入1*Buffer（超纯水稀释）100ul后根据分组分别加入2.5ulAnnexin、2.5ulPI，避光孵育15-20分钟四、上机检测加入1*Buffer200-300ul（根据上机要求），终体积350ul左右，上机检测，检测前必要时可用滤网过滤细胞，若细胞数太少不建议过滤，可直接上机检测。

SD大鼠海马神经干细胞体外培养与鉴定目的采用改良方法分离新生24h内SD大鼠海马神经干细胞（neural stem cells，NSCs），观察海马NSCs体外培养的生长状况及多向分化潜能，为后续实验研究奠定基础。

方法采用改良方法分离海马NSCs，用含终浓度为20ng/ml 的bFGF和EGF、2% B27添加剂、1%双抗、1%L-谷氨酰胺的DMEM/F12（1∶1）培养基进行传代培养，每天定时在显微镜下观察NSCs生长状况。

应用免疫荧光细胞化学技术检测原代NSCs的巢蛋白（Nestin）及第3代的NSCs加胎牛血清诱导分化7d后的神经元（NSE）、星形胶质细胞（GFAP）及少突胶质细胞（MBP）的表达。

结果倒置显微镜下观察，培养的细胞具有不断增殖、成球的能力，接种24h后，细胞即呈现倍数增长，原代培养4d即可传代培养。

免疫荧光细胞化学技术鉴定结果，Nestin、NSE、GFAP及MBP表达阳性。

结论采用改良方法分离新生24h内SD大鼠海马NSCs，经典无血清NSCs条件培养基体外培养可获得的NSCs具有较强的存活、增殖和成球能力及多向分化潜能。

标签：海马；神经干细胞；培养；鉴定神经干细胞（neural stem cells，NSCs）存在哺乳动物胚胎期的大部分脑区，而成体NSCs主要存于脑室周、海马齿状回的颗粒下层、脊髓等部位，其中以海马齿状回的颗粒下层分布较多[1]，因此成体NSCs的研究多以海马脑区多见。

传统分离细胞方法采用胰蛋白酶消化方法结合机械吹打方法。

但胰蛋白酶消化方法分离细胞存在许多弊端，比如消化过度及终止消化所用的血清对NSCs生长干扰的问题。

本实验通过单纯机械吹打方法分离提取乳鼠的海马NSCs，可以完全将海马组织吹打成单个的细胞，所获得的细胞在体外培养的过程中，表现出较强存活、增殖、成球能力和多向分化的潜能。

1.材料1. 1动物1.1 清洁级、新生24h内、雌雄不限SD大鼠10只，由广州中医药大学实验动物中心{许可证号：SCXK（粤）2008-0020}提供。

海马体神经元的兴奋性调节记忆动态的机制海马体是大脑内重要的神经结构之一，负责参与记忆的形成和储存。

而神经元作为海马体的基本单位，其兴奋性的调节对于记忆动态的机制至关重要。

本文将探讨海马体神经元兴奋性的调节以及其对记忆动态的影响。

一、激活海马体神经元的机制海马体神经元的兴奋性受多种因素影响。

一方面，外界刺激通过突触传递到海马体神经元，引起神经元的兴奋。

这一过程涉及多种神经递质的介导，如谷氨酸、谷甘肽等，这些神经递质参与了突触间的信号传递，从而激活了海马体神经元。

另一方面，内源性信号分子也在调节海马体神经元的兴奋性。

例如，海马体内存在多种神经调节因子，如乙酰胆碱、去甲肾上腺素等，它们通过与特定的受体结合，改变神经元的膜电位，从而调节神经元的兴奋性。

二、兴奋性调节与记忆动态的关系海马体神经元的兴奋性调节对于记忆动态具有重要的影响。

研究表明，增强海马体神经元的兴奋性可以改善学习和记忆能力。

例如，通过光遗传学技术可以精确操控神经元的兴奋性，在兴奋性增强的条件下，动物的学习和记忆表现出更好的效果。

另外，海马体神经元的兴奋性调节还参与了记忆的形成和巩固。

在新记忆形成的过程中，神经元的兴奋性会发生调整，形成新的突触连接，从而产生具有持久性的记忆储存。

而在记忆的巩固过程中，神经元的兴奋性调节同样起着重要的作用，保证记忆的稳定性和可靠性。

三、兴奋性调节的机制海马体神经元的兴奋性调节是一个复杂的过程，涉及多种分子和信号通路的参与。

其中，突触可塑性是一个重要的机制。

突触可塑性是指突触传递效能的可变性，可以通过长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)来实现。

这些突触可塑性的改变可以影响到海马体神经元的兴奋性调节。

此外，海马体神经元的兴奋性还受到环境因素的调节。

例如，压力和焦虑等负面因素可以改变神经元的兴奋性，进而影响记忆的形成和储存。

而正面的刺激和体育锻炼等积极因素则有助于提高神经元的兴奋性，并促进记忆的动态变化。

总结：海马体神经元的兴奋性调节对于记忆动态的机制起着重要作用。

氟西汀对海马神经元生长的影响【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。

氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。

有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。

关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。

1 材料与方法1.1 新生大鼠海马神经元的分离和培养技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。

取出生24 h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank's液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量0.25%的胰酶（美国Sigma公司），37 ℃消化30 min，中间振摇1或2次，加入10%的 DMEM/F12（美国Gibco公司）5 ml，轻轻吹打15次，然后1 000 r · min-1离心5 min，制成单细胞悬液，置于CO2 培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200 μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4 h后换为无血清培养基，即含2% B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。

使用培养 6 d的神经元进行染色鉴定。

1.2 大鼠海马神经元的鉴定1.2.1 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色取培养6 d 6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免疫组织化学染色。

弃去培养液，4%多聚甲醛室温固定1 h ，加入 0.3% H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶，0.1% TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗1∶200 兔抗鼠 NSE抗体，4 ℃湿盒过夜，0.01 mmol ·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37 ℃温箱孵育60 min;0.01 mmol · L-1 PBS 清洗，滴加SABC过氧化物酶复合物，37 ℃温箱中孵育 60 min，0.01 mmol · L-1PBS清洗，滴加 DAB显色液作用3～10 min，自来水冲洗后，常规脱水，透明封片。

可培养神经细胞类型
可以培养多种类型的神经细胞，包括但不限于以下几种常见的神经细胞类型：
1. 皮质神经元（Cortical Neurons）：这是大脑皮层中最常见的神经元类型，负责信息传递和处理。

培养皮质神经元可以研究其电生理特性、突触形成和功能等。

2. 海马神经元（Hippocampal Neurons）：海马区是与记忆和学习相关的重要脑区，培养海马神经元可以用于研究突触可塑性、长时程增强（LTP）等。

3. 神经胶质细胞（Glial Cells）：神经胶质细胞是神经系统中的非神经元细胞，包括星形胶质细胞、少突细胞和室管膜细胞等，它们在支持神经元功能和保护神经组织方面起着重要作用。

4. 嗅球神经元（Olfactory Bulb Neurons）：嗅球是嗅觉传导的主要组织，培养嗅球神经元可以研究嗅觉感知和嗅觉记忆等相关机制。

5. 神经干细胞（Neural Stem Cells）：神经干细胞具有自我更新和分化为多种神经细胞类型的能力，可以用于研究神经发育、再生和治疗等方面。

这些神经细胞类型的培养需要特定的培养基和条件，例如适当的营养物质、温度和湿度等。

对于不同的研究目的，选择合适的神经细胞类型进行培养非常重要。

大脑海马区的神经发育机理大脑是人类最重要的器官之一，是大脑皮层、海马区、小脑以及脑干等部位组成的。

而大脑海马区则是其中最为重要的一部分，其功能被认为与记忆、空间定位和学习等方面密切相关。

本文将从神经发育机理的角度来探讨大脑海马区的神经发育和影响发育的因素。

大脑海马区的神经发育机理大脑海马区存在于大脑内部，它的形状像一个海马尾巴，所以得名。

海马区对于人类学习和记忆有着重要的作用。

之前的研究表明，成年人的大脑海马区内，神经元的数量不会发生变化，这也就说明了海马区的成熟已经在出生时就已经完成了。

海马区的神经发育可以分为一下几个方面。

一、细胞生物学角度在细胞生物学角度来看，大脑海马区的神经发育主要包括神经元和突触的生长。

神经元是大脑的基本细胞，它们接收、处理和转发信号的过程形成了神经网络。

海马区的神经元分为棘细胞和锥细胞两种类型，其中棘细胞能够传递神经电信号，并参与记忆和学习等过程。

锥细胞则负责空间定位，并在标记记忆上扮演着重要的角色。

突触是连接神经元之间的纤维，也称为细胞间连接。

突触的形成和变化直接影响神经网络的效率和稳定性。

二、遗传学角度从遗传学的角度来分析海马区的发育，则是有许多基因起到了重要的作用。

其中FOXG1、Wnt、Pax6和Tbr2等都是海马区发育中被证明有着重要作用的基因。

三、环境因素的影响环境是神经发育中无法忽视的因素。

海马区的发育也受到了许多环境因素的影响，包括母亲的营养、婴幼儿期的生活环境、社会文化环境等等。

怎样维护海马区发育？保持良好的生活习惯和饮食习惯是维护海马区发育的关键。

在日常生活中，我们应该尽量避免过度的饮酒、熬夜、高油脂和高糖的饮食等不良习惯。

此外还需要特别注意的是，婴儿时期和青少年时期的大脑海马区发育是非常重要的，家长们需要保证孩子的良好生活习惯和饮食习惯。

除此之外，适当进行志愿活动、多参加社交和娱乐活动等也是有帮助海马区发育的方式。

结语总的来说，大脑海马区发育是一个复杂且多方位的过程。

神经元发育与海马记忆的关系人类是拥有高度发达大脑的物种，我们生活所需的认知和思维功能都是由大脑完成的。

大脑内部包含数亿个神经元，这些神经元构成了一个庞大的神经网络，让我们能够完成各种复杂的任务。

在这些神经元中，海马神经元是一个非常重要的组成部分。

那么神经元发育与海马记忆之间有什么关系呢？一、神经元发育对海马记忆形成的影响海马是大脑内部的一个区域，它的主要功能是参与到记忆过程中。

当人们从大脑内部的其他区域接收到信息后，信息会通过神经元相互连接最终到达海马。

在海马中，这些信息将被处理并作为长时记忆储存。

因此，海马的功能对于人类的日常生活和学习都非常重要。

然而，如何保证海马神经元的发育对海马功能起到至关重要的作用呢？事实上，神经元发育对于海马记忆的形成和巩固有着非常大的影响。

神经元的形成、生长和连接是一个复杂的过程，在这个过程中，任何小的变化都可能会影响到海马神经元的功能。

例如，在神经元形成的早期阶段，神经元的位置和连接方式就会决定其后续的功能。

如果神经元发育异常导致连接方式不正确或者位置错误，那么长时记忆的形成就会受到严重影响。

而神经元在发育的过程中会受到许多外界因素的影响，例如营养不良、疾病和环境刺激等等。

这些因素可能会导致神经元的生长受到抑制或者过度刺激，从而影响神经元的连接和功能。

二、海马记忆对神经元发育的影响除了神经元发育对海马记忆的影响之外，海马记忆本身也会对神经元发育产生影响。

例如，在海马记忆形成和巩固的过程中，神经元之间的连接是不断调整和加强的。

这种调整和加强会使得神经元的连接更加完善和密切。

而这些连接的加强和巩固会反过来促进神经元的发育，使得其生长更加健康。

此外，海马记忆还会对神经元的数量产生影响。

研究发现，当动物经历了某些学习或记忆的过程之后，其海马中的神经元数量会增加。

这是因为记忆的形成过程中需要更多的神经元从事信息的传递和储存工作。

因此，记忆的形成会促进神经元数量的增加，从而在更广泛的范围内提高大脑的功能。

实验所需用品：400μm膜；培养皿：60mm ；100mm ；离心管：1.5ml；15ml；50ml；枪头：200μl；1ml；5ml；pll(多聚赖氨酸)；H-DMEM（高糖）；P培（plating medium）；PBS液；10%水合氯醛；木瓜蛋白酶；台盼蓝染液（自配）；75%酒精;ARAC液(工作时浓度为0.0625mmol/L)大镊子；大剪刀；眼科镊；尿垫；解剖镊；1ml注射器前一天的准备1.pll(多聚赖氨酸)：10mg/ml,用时稀释20倍加pll 2ml 至60mm 皿中，3h后吸出液体，用PBS洗两次，每次2ml（放入孵箱）2.准备400μm膜（用于过滤细胞，除去大颗粒组织块）3.解剖用的100mm皿；大镊子；大剪刀；眼科镊；尿垫4.H-DMEM配制木瓜蛋白酶2mg/ml实验第一天：1.大鼠肌肉注射（大腿内侧）10%水合氯醛2ml ，两侧各1ml2.待麻醉后，放至尿垫，腹部及用具喷洒酒精3.打开腹腔，剪去脂肪层，取出子宫放入皿中，喷洒酒精，移至细胞房4.准备4个60mm皿（每个皿加4ml P培）；1个100mm皿（每个皿加6ml P培）；2个100mm皿（每个皿加6ml H-DMEM）将子宫剪开，剪去胎鼠头部放入100mm H-DMEM皿中洗一遍再放入另一个100mm H-DMEM皿中洗一遍；洗完后放至100 mm P培皿中取脑；取出的脑分别放至60mm P 培皿中（放冰上）。

取脑步骤：左手插眼固定，右手撕皮，去脑壳，取脑（使用眼科镊）5.放至解剖镜下，分离皮层与海马，步骤如下：去嗅球，小脑脑一分为二掏出部分内容物平口处撕去血管膜取出海马去除剩余内容物每取完一个脑即将皮层放至10ml P培的50ml离心管中，海马至有1ml P培的1.5ml离心管中。

6.海马：3支管（1.5ml离心管），每管800μl H-DMEM，洗3次（1ml枪头吸）皮层：2支管（50ml离心管），每管5~10ml H-DMEM，洗2次（5ml枪头吸）7.海马：1ml木瓜蛋白酶加至1.5ml离心管；15min,5min/振摇，水浴（新洁尔灭一盖），37℃。

成年大鼠海马神经元培养衰老细胞的鉴定摘要：目的：鉴定不同年龄大鼠培养海马神经元的衰老细胞鉴定。

方法：取6月龄和18月龄雄性SD大鼠海马进行原代海马神经元培养，分别在培养6d、10d和14d利用衰老相关的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）进行细胞化学染色。

结果：18月龄培养10d和14d的海马神经元SA-β-GAL染色较6月龄培养6d的海马神经元明显增多( p ＜0.001)。

结论：老年大鼠海马神经元体外培养进入衰老状态的时间较青年大鼠早。

关键词：海马神经元；衰老；衰老相关的β半乳糖苷酶衰老相关的β半乳糖苷酶（Senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL）是目前被广泛采用的一种生物学标记物，它在衰老细胞中表达升高，因此成为鉴定细胞衰老的一个标志［1，2］。

值得提出的是，有些衰老的生物学标记并不具有普遍性，SA-β-GAL作为一个衰老的生物学标记在体外检测复制衰老的细胞已经得到了广泛的认可［3］，但其是否能够用于检测衰老神经元，目前尚未得到证实，因此在应用上应加以验证。

目前对衰老细胞的研究，衰老细胞从形态学上表现为细胞变大，变扁平［4］，然而在除此以外还有端粒变短，细胞周期停滞等特征，而鉴于神经元属于静止细胞，因此在衰老细胞鉴定生物学标记的选择时具有特异性，本研究拟对培养不同天数的海马神经元进行SA-β-GAL染色，从而鉴定衰老的海马神经元，同时验证SA-β-GAL在海马神经元应用的可靠性。

1 材料与方法1.1 海马神经元原代培养分别取6月龄及18月龄雄性SD大鼠各2~3只，进行海马神经元原代培养。

取海马组织：全身75%酒精消毒，断头取脑，将整个脑组织置于冷的HBSS(无Ca2+Mg2+)平衡液中，利用弯头玻璃棒将两侧海马完整取出。

HBSS液洗4次，去除混杂的血管和血液。

胰酶消化：用剪刀将海马组织剪成1mm3的小块，用HBSS洗4次，0.25%的胰酶37℃消化15min。