大鼠海马神经元原代培养

新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。

2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。

（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。

3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。

在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。

可一次配好，-20°C保存，每次取用。

4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。

现用现配，37°C保存备用。

5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。

5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。

现用现配，37°C保存备用。

4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。

新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【摘要】目的建立一种简单、高效、稳定的海马神经元原代培养方法,以获得高纯度、高活力的海马神经元.方法 24h内新生鼠,用含B27的Neurobasal无血清培养基培养,显微镜下观察神经元的生长状态,MTS法测定不同时间神经元细胞的活力,并用Tau-1和MAP-2抗体鉴定海马神经元的纯度.结果(①接种24h后,细胞完全贴壁,可见双突起和多个突起的神经元;72h后,海马神经元胞体饱满,立体感较强,突起之间相互形成突触联系,神经元极性完全建立;5～6d的神经元,突起形成密集的神经纤维网络.②MTS法测定结果显示,在培养1～8d时间内,海马神经元随着培养时间的延长,活力增加,第8d细胞活性到达高峰,继续培养时,活力开始下降.③Tau-1和MAP-2免疫荧光检测神经元,海马神经元纯度达到(85.5±5.4)％.结论本实验方法简单易行,神经元纯度高、细胞活性好,且体外存活时间长,是神经疾病体外研究的良好细胞模型.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2016(030)004【总页数】6页(P284-287,290,封3)【关键词】海马神经元;无血清原代培养;方法;优化与鉴定【作者】郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥【作者单位】广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436;广州医科大学病理生理学教研室,广东广州511436【正文语种】中文【中图分类】R329在神经系统研究领域内，体外培养神经元细胞是研究神经元功能以及病理、生理变化的重要手段之一，在现代医学和神经科学中被广泛应用。

原代神经元[1]直接来源于动物脑组织，在形态和生理功能上都能较好的模拟动物的体内细胞，得出的数据结果更加真实可信，与神经细胞系相比，它们能提供准确的生物学信息，并且它具有机体干扰少，影响因素单一，结果容易分析等优点。

原代培养海马神经元经验一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。

神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes 是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O 至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m 微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。

二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被30 min，吸除，晾干,PBS洗三次,晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠3只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化24 min左右，期间轻摇数次；过滤：加入3mL胎牛血清(海马种植液)终止消化，静止1~2min,吸出上清液，用种植液洗三次，每次用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1000 rpm离心5 min，倾去上清，海马种植液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入含终浓度为10%胎牛血清的种植液后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；6、换液：接种后4~6h将培养液全量换成无血清B27+neurobasal培养液，(第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，)随后每3 d半量换液。

胎鼠、新生大鼠原代海马神经元培养及鉴定熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【摘要】目的:建立胎鼠、新生鼠海马神经元体外培养方法.方法:分别取胎鼠、新生鼠海马,消化后种植,用含有2%B27的neurobasal培养液培养,第3天加入5 μmol·L-1的阿糖胞苷,换液后继续培养,以获得纯度较高的海马神经元.培养第3、7天观察细胞生长及突起情况,用neurofilament抗体以免疫荧光方法鉴定神经元细胞.结果:海马神经元种植24 h后贴壁,7天时神经元突起相互连接成网络.经neurofilament染色,培养细胞阳性率高,新生鼠原代培养海马神经元阳性率达(89±3.4)%,胎鼠海马神经元阳性率达(98±1.5)%.结论: 本方法培养出的胎鼠、新生大鼠海马神经元纯度较高,可作为海马神经元模型用于进一步研究.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】3页(P354-356)【关键词】海马神经元;细胞培养;胎鼠;新生鼠【作者】熊丽娇;郭阗廷;曾治平;黄志华;曾靖【作者单位】赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南卫生健康职业教育学院外科教研室,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院全科医学VIP科;赣南医学院;赣南医学院【正文语种】中文【中图分类】R285.5海马是大脑边缘系统重要部分，神经元分布高度集中，在认知、记忆、情绪、植物神经系统方面起着不可替代的作用[1-3]。

海马神经元体外培养模型已经成为研究神经元发育分化、神经疾病的发生机制的重要技术手段[4-6]。

海马神经元体外培养文献报道方法多样，动物来源主要有胎鼠和新生鼠，根据实验条件，我们摸索出了原代胎鼠、新生大鼠的海马神经元培养方法，并进行了细胞鉴定，获得了高纯度的胎鼠、新生大鼠海马神经元。

1.1 材料1.1.1 实验动物孕17天SD大鼠及出生24 h内的SD大鼠。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、neurobasal培养基、胎牛血清(FBS)和B27培养基添加剂(Gibco公司)、青链霉素、胰酶、多聚L赖氨酸(sigma公司)。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化张金波,王淑秋,朱金玲,罗佳滨,张淑红,金岳雷(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯154007)摘要:目的:建立海马神经细胞原代培养技术。

方法:取新生1～3d 的W istar 大鼠,开颅,迅速分离出海马组织在H ank s 中剪碎,加入0.125%胰蛋白酶2mL 消化,胎牛血清终止消化,细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中。

结果:神经细胞存活率高,纯度达90%以上,神经细胞生长良好。

结论:用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞。

关键词:海马神经细胞;原代培养;胰蛋白酶中图分类号:Q 421;R 388　文献标识码:A 文章编号:1008-0104(2009)04-0020-02 海马锥体神经元是海马区的主要成分,主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节,是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一[1]。

为了能在细胞水平和分子水平深入研究发育中海马神经细胞的生化、代谢、生理、药理及形态,建立海马神经细胞原代分散培养技术,越来越引起基础医学和临床医学的重视。

1　材料与方法1.1　动物与试剂实验动物:新生1～3d 的W istar 大鼠,由佳木斯大学实验动物中心提供。

主要试剂:N euralbasal 培养基、B 27培养基添加剂、青链霉素(Gibco 公司产品),胰蛋白酶、胎牛血清、多聚赖氨酸(Sigm a 公司产品),阿糖胞苷(上海华联制药有限公司)。

1.2　方法1.2.1　培养板的处理在取海马前一天,用35mm 孔径的6孔培养板,每个孔中加入0.1g L 的聚L -赖氨酸2mL ,静止30m in 除去溶液,用三蒸水冲洗3遍,放入二氧化碳培养箱内过夜待用。

1.2.2　培养方法取新生1～3d 的W istar 大鼠,用95%乙醇消毒,开颅,剥离脑膜,迅速分离出海马组织在H ank s 液中剪碎约1mm 3,然后离心500r m in ,5m in ,去掉H ank s 液,加入0.125%胰蛋白酶2mL ,消化约20m in (37℃、5%CO 2条件下),中间轻轻振摇2～3次,尽量去除胰酶,加入10%胎牛血清终止消化,离心500r m in ,5m in ,去上清,加入无血清培养基,用火焰刨光的玻璃吸管轻轻吹打数次,用200目的细胞筛过滤后,取0.1mL 按台盼蓝拒染法进行活细胞计数,制成5×105 mL 密度的细胞悬液,种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中,每孔加2mL ,24h 后全量换无血清培养基。