小鼠海马神经元细胞使用说明

海马神经元原代培养方法肖兴莉;杨朝鲜;高小青;陈秀【期刊名称】《泸州医学院学报》【年(卷),期】2014(37)2【摘要】目的:掌握海马神经元的有效培养方法和细胞保存培养方法,利于细胞模型的建立.方法:取出出生1d的SD大鼠海马,联合机械吹打法和胰酶消化法分离海马细胞,加入DMEM/F12+10％FBS制备细胞悬液,接种在玻璃培养瓶内1～2 d,收集上清细胞液、离心、重悬细胞;再接种在培养板上,培养1d后,全液更换为Neurobasal+2％ B27,以后每3d半量换液.利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;利用NF-200、Neu-N抗体免疫荧光、免疫组化技术鉴定海马神经元;利用96孔板培养细胞,计数每个孔海马细胞比例;利用MTT法测定细胞活性.结果:接种在培养板上第1d细胞贴壁,第3～4 d细胞长出突触,第7～8d细胞突触生长迅速,第11～13 d细胞交织成网状,第15～20 d细胞生长旺盛,20 d后细胞形态开始改变.免疫荧光技术鉴定细胞突触呈红色,细胞核呈绿色;免疫组化技术鉴定突触和胞核都呈棕黄色.细胞纯度95～97.5％,细胞活性以15～17 d最高(93.94 ～ 95.13％),与其他时间点比较,P＜0.01.结论:该方法简便可行,节约取材及时间,可获得纯度高、活性好的海马细胞,为后续研究提供实验基础.【总页数】4页(P175-178)【作者】肖兴莉;杨朝鲜;高小青;陈秀【作者单位】泸州医学院附属医院神经内科,四川泸州646000;泸州医学院神经生物教研室,四川泸州646000;泸州医学院神经生物教研室,四川泸州646000;泸州医学院附属医院神经内科,四川泸州646000【正文语种】中文【中图分类】R741【相关文献】1.新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定 [J], 郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥;2.简易大鼠海马神经元原代培养方法及神经元兴奋性检测 [J], 张小娟;李廷玉;刘友学;陈洁;瞿平;魏小平;何剑3.新生大鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定 [J], 郭明星;陈浩宇;梁璐;张常娥4.海马神经元原代细胞培养方法的改良 [J], 高超;杜贵琴;许永劼;朱金凤;潘卫;李兴5.海马神经元原代细胞培养方法的改良 [J], 高超;杜贵琴;许永劼;朱金凤;潘卫;李兴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

胎鼠海马神经元体外原代培养与鉴定在神经生物学及相关学科领域中，原代培养的神经元因其排除机体生理病理状态干扰的影响而成为较为理想的实验模型，是研究神经元形态、物质代谢、分子机制及电活动的主要前提。

海马是大脑边缘系统重要的组成部分，在学习、记忆、情绪反应及中枢神经系统疾病的病理生理变化方面发挥着重要作用。

对于原代海马神经元的培养，主要供体主要有胎鼠与新生鼠两种，培养方法有含血清培养和不含血清培养两种。

我们通过实验摸索，取得一种较稳定且简便实用的方法，能获得较高存活率的海马神经元。

1 材料与方法1.1 实验动物来源清洁级孕17-19天SD大鼠上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 主要仪器与试剂 CO2培养箱（Thermo公司），倒置相差显微镜为（Olympus公司），激光共聚焦显微镜型号为ZEISS LSM710，小鼠抗大鼠classⅢβ-Tubulin单抗（Beyotime公司），NSE免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程XX公司），B27添加剂、Neuralbasal、Hoechst 33342Sigma 公司），DMEM（高糖型）培养基、胎牛血清（Gibco公司）。

1.3 培养方法与鉴定取孕17-19天大鼠，水合氯醛麻醉后70%酒精浸泡20min，颈椎脱臼法处死孕鼠，将子宫立即放入冰浴含DMEM的大平皿中，在解剖显微镜下取下海马组织，剪成约1mm×1mm×1mm大小，用0.125%胰蛋白酶于37℃、5%CO2培养箱中消化15min，中间每隔5min振荡一次，加入含10%FBS的DMEM 液终止消化，巴氏管轻柔吹打，200目筛网过滤。

1000r/min离心5min，弃上清，并加入适量的含2%B27无血清Neuralbasal培养基，用巴氏管吹打成细胞混悬液。

吹打后以0.4%台盼蓝染色计数活细胞并调整细胞悬液的细胞密度，以5×105个/ml的细胞密度接种于预先经0.05%多聚赖氨酸包被的6孔板（1.5ml/孔），置于37℃、5%CO2培养箱培养，24h后换培养基继续培养，以后每周更换维持培养基2次，每次半量换液。

小鼠海马组织提取过程
小鼠海马组织提取过程
海马是大脑皮层中与记忆处理相关的区域，小鼠海马组织提取过程是神经科学研究中重要的一步。

下面将介绍小鼠海马组织提取的步骤和注意事项。

步骤一：准备实验材料
需要准备组织切片刀、显微镜、培养培养皿、离心机等实验材料；还需要购买磷酸盐缓冲液(PBS)、胶原酶等药品。

步骤二：准备小鼠海马
在实验前将小鼠捕捉并消毒，随后在其头部进行开颅手术，取出大脑组织样本，分离出小鼠海马组织。

步骤三：组织分离
将小鼠海马组织切成小块，用胶原酶等酶类溶液进行处理，避免组织死亡和堆积。

处理后的组织可以通过显微镜进行查看，并且在操作中应让操作规范化和标准化，以避免人为干扰。

步骤四：离心处理
将处理后的小鼠海马组织进行离心处理，取出其上清液，用PBS溶液进行洗涤，防止污染物质残留。

步骤五：离心沉淀
将洗涤后的小鼠海马组织进行离心沉淀，分离出其中的细胞块，获得目标提取物质。

注意事项：
1. 在处理小鼠海马组织的过程中，应防止组织的氧化和干燥，避免影响实验结果。

2. 在组织分离的过程中，应选择合适的酶类溶液，并进行恰当的组织处理处理。

3. 在离心沉淀的时候，顶部要避免和底部过于接近，避免损坏组织和提取物。

小鼠海马组织的提取对于神经科学研究具有重要的作用，在实验中应遵守实验规范，保护动物权益，准确完成实验操作。

海马神经元培养（1）材料①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103)L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504)③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025)⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175)⑥trypsin 胰酶⑦NaHCO3⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝⑩巴氏吸管，前端用火抛光刻度吸管离心管闪烁瓶玻璃培养皿：小：3套大：2套冰袋、纱布手术器械、筛网培养瓶或培养板（2）步骤①准备a．配制试剂i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中）配制硼酸缓冲液（pH8.4）A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存4.5mlA液+5.5mlB液5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。

ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水NaHCO3：0.175g加入溶液1M NaOH 调节pH至7.2-7.4纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存iii）1M NaOH溶液配制NAOH：4g 溶于100ml纯水iv）0.125%胰酶+0.02%EDTAD-Hank’s溶液10mlEDTA 20mg 溶解后D-Hank’s溶液80ml胰酶125mg 溶解后1M NaOH溶液调节pH至7.2D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水NaHCO3：0.088g加入溶液HEPES：0.596g加入溶液Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液1M NaOH 调节pH至7.4纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水NaHCO3：0.088g加入溶液HEPES：0.596g加入溶液Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液1M NaOH 调节pH至7.4纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存vii）10%FBS的DMEM/F12（D/F12）90ml D/F1210mlFBSviii）Neurobasal/2% B27-A （0.5 mM glutamine， 25 μM glutamate ）Neurobasal： 98mlB27： 2ml200mM glutamine： 0.25ml25mM glutamate： 0.1mlix）Neurobasal/2% B27-B （0.5 mM glutamine）Neurobasal： 98mlB27： 2ml200mM glutamine： 0.25mlb．消毒：手术器械：眼科剪、眼科镊、筛网培养皿：玻璃培养皿：小：3套，大：2套纱布闪烁瓶、离心管巴氏吸管、刻度吸管（培养瓶、盖玻片等）c．塑料培养瓶或培养板的清洗、紫外消毒d．Poly-D-lysine 包被：将配制好的P-D-L铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱1h或过夜。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤1.确定实验目的：在进行任何实验之前，首先需要明确实验的目的和研究问题，以确定所需的实验材料和方法。

2.准备实验材料：准备所需的实验材料，包括培养基、细胞培养试剂和培养器具等。

3.小鼠胚胎的取材：通过异交法得到小鼠胚胎，通常在胚胎发育第15-17天时取材。

使用无菌饲料给小鼠提供丰富的营养，使其胚胎发育良好。

4.分离大脑皮层组织：将小鼠胚胎处死后，将其大脑取出并置于无菌的PBS缓冲液中。

然后用剪刀将大脑的外围组织移除，只保留皮层组织。

5. 组织的化学消化：将取出的大脑皮层组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用Pipettor将组织切碎成较小的块状，并加入含有0.05%胰蛋白酶和0.1%DNA酶的消化液，室温下消化15-20分钟。

6.组织的离心：将消化液中的细胞悬液经过离心处理，用PBS缓冲液洗涤1-2次，去除消化液中的酶和杂质。

7.细胞计数和分装：用显微镜和细胞计数板对细胞悬液进行计数，通过稀释和分装的方法，得到所需的细胞浓度。

8.细胞接种：将细胞悬液均匀地滴加到含有预先涂覆了聚-L-赖氨酸的培养皿中，使细胞均匀附着在培养皿的表面上。

9.培养基的添加：在细胞接种后，将预先配制好的培养基加入培养皿中，以提供细胞所需的营养和生长因子。

10.培养条件的控制：将培养皿放置于恒温培养箱中，温度为37°C，湿度为95%，CO2浓度控制在5%左右。

每隔一段时间，检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞的健康生长。

11.细胞形态观察：使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，观察细胞的神经突起、细胞形态和相互作用等。

12.细胞维持和传代：根据实验需要，定期更换培养基以提供细胞所需的营养和生长因子。

当细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代，使细胞继续生长。

小鼠大脑皮层神经元原代培养是一项复杂的实验技术，在操作过程中需要注意无菌操作、细胞的取材和处理、培养条件的控制等方面的细节。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，％酒精浸泡1小时以上消毒。

70以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用－80 器皿：玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，1)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

2)3)培养瓶、盖玻片次，0.2N用蒸馏水洗2盐酸浸泡10分钟，培养用的盖玻片必须不含铅、4)不发霉，可用分钟，每次次，10分钟，10每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10再用双蒸水洗2 烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

孔）。

96246）塑料培养皿（6)35mm、塑料培养板（、、辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

培养基和培养用液的配制2.7-1400001)??培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为，浓度为Poly-L-lysine0.1mg/ml。

多聚赖氨酸（平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于2)?? 的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

NaCl培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，3)?? 6g/L培养液应含有或加葡萄糖至。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

℃有胎牛血清、4)??血清：小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56 灭活30分钟）。

胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后5)??1-2ml℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤:1、于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑；2、预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块；3、移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培养箱中消化30min；4、将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液；5、最后再用接种液1ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用；6、加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块；7、收集含单细胞悬液的上清液约4-5ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中；8、培养24h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况；9、换用阿糖胞苷培养液(终浓度2.5ug/ml，换半液)培养3d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞；10、每隔3d换全培养液1次，每次换半液。

神经元免疫化学鉴定:1、4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤3次；2、加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30min，PBS洗涤3次；3、加入5%羊血清封闭20min，弃去多余液体；4、加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4h，PBS洗涤3次；5、加入Cy3-羊抗兔IgG（1:50）和20µl抗荧光衰减封片剂，室温放置1h；6、加入DAPI染液（1:40），室温放置5-10min；PBS洗涤3次。

7、荧光显微镜观察；。

实验所需用品：400μm膜；培养皿：60mm ；100mm ；离心管：1.5ml；15ml；50ml；枪头：200μl；1ml；5ml；pll(多聚赖氨酸)；H-DMEM（高糖）；P培（plating medium）；PBS液；10%水合氯醛；木瓜蛋白酶；台盼蓝染液（自配）；75%酒精;ARAC液(工作时浓度为0.0625mmol/L)大镊子；大剪刀；眼科镊；尿垫；解剖镊；1ml注射器前一天的准备1.pll(多聚赖氨酸)：10mg/ml,用时稀释20倍加pll 2ml 至60mm 皿中，3h后吸出液体，用PBS洗两次，每次2ml（放入孵箱）2.准备400μm膜（用于过滤细胞，除去大颗粒组织块）3.解剖用的100mm皿；大镊子；大剪刀；眼科镊；尿垫4.H-DMEM配制木瓜蛋白酶2mg/ml实验第一天：1.大鼠肌肉注射（大腿内侧）10%水合氯醛2ml ，两侧各1ml2.待麻醉后，放至尿垫，腹部及用具喷洒酒精3.打开腹腔，剪去脂肪层，取出子宫放入皿中，喷洒酒精，移至细胞房4.准备4个60mm皿（每个皿加4ml P培）；1个100mm皿（每个皿加6ml P培）；2个100mm皿（每个皿加6ml H-DMEM）将子宫剪开，剪去胎鼠头部放入100mm H-DMEM皿中洗一遍再放入另一个100mm H-DMEM皿中洗一遍；洗完后放至100 mm P培皿中取脑；取出的脑分别放至60mm P 培皿中（放冰上）。

取脑步骤：左手插眼固定，右手撕皮，去脑壳，取脑（使用眼科镊）5.放至解剖镜下，分离皮层与海马，步骤如下：去嗅球，小脑脑一分为二掏出部分内容物平口处撕去血管膜取出海马去除剩余内容物每取完一个脑即将皮层放至10ml P培的50ml离心管中，海马至有1ml P培的1.5ml离心管中。

6.海马：3支管（1.5ml离心管），每管800μl H-DMEM，洗3次（1ml枪头吸）皮层：2支管（50ml离心管），每管5~10ml H-DMEM，洗2次（5ml枪头吸）7.海马：1ml木瓜蛋白酶加至1.5ml离心管；15min,5min/振摇，水浴（新洁尔灭一盖），37℃。

阿司匹林通过铁死亡减轻氧糖剥夺复氧的小鼠海马神经元细胞损伤的作用机制目录一、内容概览 (2)1.1 背景与意义 (2)1.2 研究目的与问题 (3)1.3 文献综述 (4)二、阿司匹林的药理作用与机制 (6)2.1 阿司匹林的化学结构与性质 (7)2.2 阿司匹林的抗炎作用 (7)2.3 阿司匹林的抗氧化作用 (9)2.4 阿司匹林的抗血小板聚集作用 (10)三、氧糖剥夺复氧模型介绍 (11)3.1 氧糖剥夺复氧的定义 (12)3.2 氧糖剥夺复氧的实验模型 (12)3.3 氧糖剥夺复氧对神经元的损伤作用 (13)四、阿司匹林减轻氧糖剥夺复氧损伤的作用机制 (14)4.1 阿司匹林的抗氧化作用对抗氧化应激 (15)4.2 阿司匹林的抗炎作用减轻炎症反应 (17)4.3 阿司匹林的抗血小板聚集作用减少血栓形成 (18)4.4 阿司匹林的神经保护作用机制 (19)五、实验研究 (20)5.1 实验材料与方法 (21)5.2 实验结果 (22)5.3 结果分析 (23)六、结论与展望 (24)6.1 研究结论 (25)6.2 研究不足与展望 (26)一、内容概览阿司匹林通过抑制铁死亡关键酶——谷氨酸脱羧酶的活性，从而减少神经元的氧化应激反应，降低铁死亡水平。

阿司匹林能够减轻线粒体功能障碍，维持线粒体稳态，进而保护神经元免受损伤。

阿司匹林还能通过抑制炎症反应，减少细胞因子释放，进一步缓解神经元损伤。

阿司匹林还能促进神经营养因子的产生和释放，为神经元提供必要的营养支持，促进神经功能的恢复。

阿司匹林通过多种途径减轻氧糖剥夺复氧所导致的小鼠海马神经元细胞损伤，展现出良好的神经保护作用。

这些发现为阿司匹林在临床上的应用提供了新的思路和依据。

1.1 背景与意义随着现代生活节奏的加快和工作压力的增大，神经系统疾病的发生率逐年上升，尤其是与氧糖代谢相关的疾病备受关注。

OGDR）是一种常见的病理过程，在缺血再灌注、中风等神经性疾病中发挥着重要作用。

原代神经元细胞的分离培养（小鼠）
本实验是自己实验室平时做的（仅供参考）
实验材料的准备：出生24h以内的小鼠若干只；预冷的pbs（不含钙、镁离子）；DMEM（高糖）培养液（实验之前预热）；75%酒精；尖头镊子、小剪刀；含EDTA的胰酶（实验之前预热）；神经元细胞培养液；灭菌的1.5mlEP管若干只
实验阶段：（整个操作保持无菌）
1，取小鼠用酒精擦拭全身，用剪刀剪下小鼠头部，小心剥下头皮和脑壳后取出整个脑子放入预冷的pbs中（也可以把pbs放在冰盒上面）
2，用剪头镊子小心剥下脑膜、小脑和大脑中的血管后将其放进1.5mlEP管中
3，用小剪刀反复剪（感到手很累了为止），然后用1ml枪头将其加入预热的胰酶中，反复吹打几次后放进37℃ 5%CO2培养箱中孵育20min，期间晃一晃有利于重复消化
4，消化时间到了之后，用含血清的DMEM培养液终止消化后，用吸管反复吹大几次
5，过筛网：用大概200目的筛网过滤后，计数种于培养皿中（培养皿提前一天用多聚赖氨酸包被）（6cm dish种300w个为好）
6，24h后，换成神经元培养液，48h后加入5-氟-脱氧尿苷（终浓度20ug/ml），以后每3-4天换半液。