木瓜蛋白酶脱除桔皮多糖杂蛋白的研究

农产食品科技２０１２，６（１）：１４　１６　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　

木瓜蛋白酶脱除桔皮多糖杂蛋白的研究　

江晓婉，陈　超，宋　茹※　

（浙汀海洋学院食品与药学学院，舟ＩＩＩ　３１６０００）　

摘要：采用木瓜蛋　酶水解桔皮多糖中的杂蛋白，为多糖精制奠定基础。分别研究了木瓜蛋白酶添加　

量、酶解温度、酶解时ｆ１＝Ｉ】和ｐＨ值对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响，然后在单因素实验的基础上进行ｋ（３　）正交实　

验，得到木瓜蛋白酶水解情皮多糖蛋白的最佳条件为：木瓜蛋白酶添加量２％（ｗ／ｖ），酶解温度４５℃，酶解２　ｈ和　

反应ｐＨ值５．０，该条件下的拈皮多糖杂蛋白脱除率达到６５％以上。　

关键词：桔皮；粗多糖；木瓜蛋白酶；蛋白质水解　

中图分类号：ＴＳ２０１．２＊５　文献标识码：Ａ　

Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｃｉｔｒｕｓ　Ｐｅｅｌ　ＰＯＩｙＳａＣＣｈａ　ｒｉｄｅ　ｂｙ　Ｐａｐａｉｎ　

ＪＩＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｗａｎ，ＣＨＥＮ　Ｃｈａｏ，ＳＯＮＧ　Ｒｕ　

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｓｈａｎ　３１６０００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｉｓ　ｔｏ　ｒｅｍｏｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｃｉｔｒｕｓ　ｐｅｅｌ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｂｙ　ｐａｐａｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，　

ａｎｄ　ｔｏ　ｌａｙ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｔｒｕｓ　ｐｅｅｌ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｖａｒｉａｂｌｅｓ　ｔｈａｔ　ａｆｆｅｃｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　

ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｐａｐａｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ，ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｗｅｒｅ　

ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｏｆ　（３４）ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｖａｒｉａｂｌｅｓ　ｗａｓ　

ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐａｐａｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　

ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｐａｐａｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　２％ｆｗ／ｖ），ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　４５℃，ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　２　ｈ　ａｎｄ　

ｐＨ　ｖａｌｕｅ　５．０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｉｔｒｕｓ　ｐｅｅｌ　

ｐ０ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｗａｓ　ａｂｏｖｅ　６５％．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｉｔｒｕｓ　ｐｅｅｌ；Ｒｏｕｇｈ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；Ｐａｐａｉｎ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　

植物多糖常常与蛋白质结合在一起，提取植　

物水溶性多糖时，植物组织中的游离蛋白质及与　

多糖结合在一起的结合型蛋白也同时被提取出　

来，因此多糖精制通常需要经过脱除杂蛋白处理。　

化学法是目前常用的蛋白脱除法，主要包括Ｓｅｖａｇ　

法、盐酸法、三氯乙酸法，虽然化学法可以有效除　

去多糖液中的游离型蛋白质，但并不适合结合型　

蛋白质的脱除Ｉ．一　。刘晓红等用木瓜蛋白酶水解金　

樱子粗多糖，然后再结合Ｓｅｖａｇ法有效去除了多　

糖液中杂蛋白［３１。桔皮多糖是一种水溶性多糖，已　

经在前期实验中证实该水溶性多糖含有一定量结　

合型蛋白。本研究利用木瓜蛋白酶水解桔皮多糖，　

多糖液中结合型蛋白质被释放后可进一步被水解　

生成小分子氨基酸类，有利于与大分子桔皮多糖　

收稿日期：２０１１－１２—２３　作者简介：江晓婉（１９９０一），女，浙江杭州人，学士。　

通讯作者　的分离。本研究主要考察木瓜蛋白酶在不同水解　

条件下对桔皮多糖杂蛋白的脱除率影响，通过正　

交实验优化最佳水解条件，旨在为桔皮多糖精制　

奠定基础。　

ｌ材料与方法　

１．１　材料　

１．１．１桔皮水溶性多糖　

实验室自制，具体制备方法参照文献【　Ｉ进行。　

１．１．２主要仪器设备　

ＨＨ一４型数显恒温水浴锅；￥５４型紫外可见分　

光光度计；ＰＢ一２０型ｐＨ计；ＤＬ一５型低速大容量离　

心机。　

１．２　实验方法　

１．２．１蛋白质含量测定　

参照文献Ｉ　Ｉ方法进行，取浓度为２Ｏ、４０、６０、　

８０、１００　ｇ／ｍＬ的牛血清白蛋白各１　ｍＬ，分别加　

入５　ｍＬ　Ｂｒｏａｄｆｏｒｄ显色剂，

漩涡混合均匀后，室温　２０１２　江晓婉等：木瓜蛋白酶脱除桔皮多糖杂蛋白的研究　ｌ５　

静置５　ｍｉｎ，以１　ｍＬ蒸馏水代替牛血清白蛋白，其　

他反应条件相同，作为零管调零，测定不同浓度牛　

血清白蛋白显示反应后５９５　ｎｍ处的吸光值，以样　

品浓度（ＩＸｇ］ｍＬ）为横坐标，吸光值大小为纵坐标，　

绘制蛋白质标准曲线。将桔皮多糖液稀释适当倍　

数，按照蛋白质标准曲线方法测定５９５　ｎｍ处吸光　

值，然后根据标准曲线计算出桔皮多糖液中蛋白　

质含量。　

１．２．２水解条件对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

桔皮多糖经过木瓜蛋白酶水解后，经９５℃　

１００℃加热灭酶１５　ｍｉｎ，冷却至室温，然后４８００　Ｘ　ｇ　

离心１５　ｍｉｎ，取上清液根据实验方法１．２．１测定　

蛋白质含量，按照下面公式计算桔皮多糖蛋白质　

的脱除率：　

蛋向质脱除率（％）＝　篮壹瞳　菜　篓　巡×１００　

以桔皮多糖的蛋白质脱除率为指标，研究木　

瓜蛋白酶添加量、酶解温度、酶解时间和ｐＨ值对　

桔皮多糖杂蛋白的脱除率影响，然后在单因素实　

验基础上进行四因素三水平的　（３　）正交实验，优　

化最佳的酶解反应条件。　

２结果与分析　

２．１　蛋白质标准曲线制作　

趔　

量　∞　器　

０　２０　４０　６０　８Ｏ　１Ｏｏ　１２Ｏ　浓咬（ｕ　ｊ　

图１　牛血清白蛋白标准曲线制作　

由图１可知经过线性拟合后牛血清白蛋白标　

准曲线为ｙ＝Ｏ．００６ｘ＋０．０３０１，Ｒ　＝０．９８８９，在浓度为　

０～１００　ｇ／ｍＬ范围内，具有高线性关系。　

２．２　水解条件对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

２．２．１　木瓜蛋白酶添加量对桔皮多糖杂蛋白脱　

除率影响　

取一定量桔皮多糖液，分别按照０．５％、　

１．Ｏ％、２．０％、３．Ｏ％、４．０％（ｗ／ｖ）比例加入木瓜蛋白　

酶，在相同条件下进行水解反应（酶解温度４５℃，　

酶解１　ｈ，ｐＨ值５．５），木瓜蛋白酶添加量对桔皮多　糖杂蛋白脱除率影响（见表１）。　

表１　木瓜蛋白酶添加量对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

添加量（％）０．５　１．０　２．０　３．０　４．０　

蛋白脱除率（％）　３９．５５　４６．５１　６７．７２　５８．０２　４１．３５　

由表１看出木瓜蛋白酶用量在０．５％一２．０％　

范围内，随着木瓜蛋白酶用量的增加，桔皮多糖液　

中蛋白质脱除率也逐渐地增加。但是，当木瓜蛋白　

酶的添加量大于２．０％后，桔皮多糖中蛋白质脱除　

率则是随着酶量的加大而逐渐地降低。木瓜蛋白　

酶可以通过水解作用将与桔皮多糖结合在一起的　

蛋白质水解，而释放出来蛋白质经过加热变性作　

用会自动与其他悬浮物质形成沉淀聚集体，然后　

通过离心分离与水溶性多糖液分离。但是加入过　

多的木瓜蛋白酶会进一步水解蛋白质生成水溶性　

好的多肽或者寡肽类，这类物质在加热条件下也　

不易发生变性而沉淀，特别是大分子肽类能够与　

Ｂｒｏａｄｆｏｒｄ显色剂呈现阳性反应，结果表现为蛋白　

质脱除率降低。另一方面，木瓜蛋白酶本身是一种　

蛋白质，加入量过大也会增加滤液中蛋白质含量，　

结果也会表现出蛋白质脱除率降低。　

２．２．２酶解温度对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

测定酶解温度分别为４０、４５、５Ｏ、５５和６０℃，　

其它酶解反应条件相同（木瓜蛋白酶添加量　

２．０％，酶解１　ｈ，酶解ｐＨ值５．５），桔皮多糖杂蛋白　

的脱除率（见表２）。　

表２酶解温度对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

酶解温度（℃）４０　４５　５０　５５　６０　

蛋白脱除率（％）４５．０７　５０．２８　６１．３４　３４．６４　３１．３３　

在酶解温度４０ｃＣ　５０℃范围内，桔皮多糖蛋　

白质的脱除率随着温度的升高而增加，当反应温　

度为５０℃时蛋白质脱除率最高达到６１．３４％，然　

后随着酶解温度的升高蛋白质脱除率快速降低。　

因为酶解温度过高会降低木瓜蛋白酶的活性，所　

以酶解反应要控制适宜的温度。　

２．２．３　酶解时间对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

酶解时间分别为１．０、１．５、２．０、２．５、３．０　ｈ，其　

它酶解反应条件相同（木瓜蛋白酶添加量２．０％，　

酶解温度５０￣Ｃ，酶解ｐＨ值５．５），桔皮多糖杂蛋白　

脱除结果（见表３）。　

表３酶解时间对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

酶解时间（ｈ）　１．０　１．５　２．０　２．５　３．０　

蛋白脱除率（％）　３８．３３　６１．７６　４７．３４　ｌ堇　咖　黝　伽　黜　㈣　ｎ　Ｑ　Ｑ　Ｑ　Ｑ　Ｑ　Ｑ　

Ｑ　ｌ６　农产食品科技　

表３显示酶解时间＜１．５　ｈ时，桔皮多糖液中　

蛋白质的脱除率随着酶解时间的增加而加大。当　

酶解时间大于１．５　ｈ后，桔皮多糖液的蛋白质脱　

除率迅速地降低，可能与酶解时间延长，生成水溶　

性大分子量肽类有关，结果离心后上清液中高分　

子量肽类含量增加，采用Ｂｒｏａｄｆｏｒｄ法测定的上清　

液中蛋白质含量偏高，造成桔皮多糖杂蛋白脱除　

率降低。　

２．２．４　ｐＨ值对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

调节桔皮多糖液ｐＨ值分别为５．０、５．５、６．０、　

６．５、７．０，其它酶解反应条件相同时（木瓜蛋白酶用　

量为２．０％，酶解温度５０℃，酶解时间１．５　ｈ），桔　

皮多糖杂蛋白的脱除效果（见表４）。　

表４　ｐｌ－Ｉ值对桔皮多糖杂蛋白脱除率影响　

ｐＨ值　５．０　５．５　６．０　６．５　７．０　

蛋白脱除率（％）　４８．９３　５５．２０　４５．３３　２１．１　１　１４．３９　当ｐＨ值为５．５时，木瓜蛋白酶对桔皮多糖杂　

蛋白的脱除率达到５５．２０％，当ｐＨ值大于５．５后，　

桔皮多糖液的杂蛋白脱除率开始明显下降，因为　

反应体系ｐＨ过高或过低均不利于木瓜蛋白酶活　

性保持。　

２．３木瓜蛋白酶脱除桔皮多糖杂蛋白优化实验　

在单因素实验基础上，进行木瓜蛋白酶使用　

量、酶解温度、酶解时间和酶解ｐＨ值四因素三水　

平Ｌ９（３４）Ｉ￣＿交实验，具体实验安排及结果（见表５）。　

极差值Ｒ大小反映出影响桔皮多糖杂蛋白　

脱除率的主次影响因素顺序为酶添加量（Ａ）＞酶解　

温度（Ｂ）＞酶解时间（Ｃ）＞酶解ｐＨ（Ｄ），木瓜蛋白酶　

脱除桔皮多糖杂蛋白最佳条件为Ａ　Ｂ　Ｃ，Ｄ，，即：木　

瓜蛋白酶添加量２．０％，酶解温度４５℃，酶解时间　

２　ｈ，ｐＨ值５．０。经测定该条件下桔皮多糖蛋白质的　

脱除率大于６５％，高于表５中的蛋白质脱除率最高　

值，说明实验所确定的最佳酶解条件是合理的。