木瓜蛋白酶提取实验记录

实验一、木瓜蛋白酶活性测定实验(明胶法)(一)实验原理木瓜蛋白酶从明胶中分解出氨基酸和肽，其氨基型氮可用甲醛复分解，产生氢离子，浓度可用氢氧化钠溶液滴定。

(二)定义一个木瓜蛋白酶单位相当于在规定条件下分解1ug分子量的肽键时所需的酶量。

(三)试剂1. 底物明胶2. 柠檬酸盐缓冲液(pH5.0) 取70.000g一水柠檬酸溶于720mL 1mol/L氢氧化钠溶液中。

用1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至5.0，用蒸馏水定容至1000mL。

3. 37%甲醛溶液4. 酚酞溶液取0.5g酚酞溶于95%的乙醇中，并定容至50mL。

5. 0.1mol/L氢氧化钠溶液取4.0克氢氧化钠置于洁净干燥的烧杯中，加纯水稀释、搅拌溶解，将溶液移入1000ml洁净容量瓶中定容至刻度。

6. 酶溶液用蒸馏水溶解酶，每毫升配制溶液应含有40U左右。

酶的称量一定得按以下原则确定：用于主值和空白值试验的耗量之差应在1.8～2.2mL这一范围内。

此外需用一个合适的称量重复测定几次。

(四)操作步骤称取500mg明胶放入一只100mL锥形烧瓶内，加8mL蒸馏水，加热后明胶溶解。

待明胶完全溶解加2.0mL柠檬酸盐缓冲液，置于水浴中冷却至40℃。

加5.00mL已预热至40℃的酶溶液，于40℃下保温60min，加10.0mL甲醛溶液终止反应。

加0.5mL酚酞溶液后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，直至第一次出现明显的粉红色为终点。

用同样方法测定空白值，只是这里在添加酶溶液之前先添加甲醛溶液。

在空白值测定方面耗去大约5mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液。

(五)计算用以下公式计算酶活性：酶活力(U/mg)=(H-B)/E W×100式中：H-用于主值的滴定耗量(mL)；B-用于空白值的滴定耗量(mL)；100-相当于1mL0.1mol/L氢氧化钠溶液；E W-每5.0mL所用酶液中含有酶的重量(mg)。

举例：测定一个木瓜蛋白酶样品。

从样品中称取68.2mg，定容100mL。

木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。

-20 ℃存放。

（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。

）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。

可省略。

3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。

一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。

2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。

3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。

二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。

木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。

本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。

三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。

（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。

（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。

（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。

3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。

（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。

（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。

木瓜蛋白酶在肉类中的嫩化作用实验摘要：我们以腊牛肉为例，通过使用木瓜蛋白酶，复合磷酸盐和腌制时间对腊牛肉嫩化效果的影响，结果表明：用0.02％木瓜蛋白酶、0.4％复合磷酸盐、经过72h腌制后，嫩化效果最佳。

木瓜蛋白酶是一种从未成熟的木瓜果实中提取的一种蛋白质分解酶，是一种天然的食品酶制剂。

由212个氨基酸残基组成单链蛋白质，分子量为23 406 D．在一定的酸性、中性、碱性范围内均具有活性。

木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白的酶，它之所以能对肉类进行嫩化，是因为它能将肉中的结缔组织及肌纤维中结构较复杂的胶原蛋白、弹性蛋白进行适当降解，使得它们结构中的一些连接键发生断裂，在一定程度上破坏了它的结构，从而大大提高了肉的嫩度。

同时可使肉的风味得到改善，并且安全、卫生、无毒，不产生任何不良风味。

木瓜蛋白酶对于胶原纤维蛋白在40～ 70℃温度范围内有最强的活力，由于脱水干燥时温度在50℃左右能较大程度地利用木瓜蛋白酶降低肉硬度的性质。

嫩化原理：嫩度是指肉在切割时，对破裂的抵抗力。

肉质的老韧主要由肉类中结缔组织的致密度大小、含水量的多少、弹性纤维的多少所决定。

材料和方法牛肉从市场上选购肉质新鲜黄牛肉，剔除筋腱、肥膘。

调味料碘盐、白糖、花椒粉、五香粉等。

食品添加剂硝酸钠、多聚磷酸钠、焦磷酸钠、磷酸二氢钠等均为食品级或分析纯。

木瓜蛋白酶活力为4O万活力单位/克。

设备及用具嫩度计、天平、台称、包装袋、容器、调温烘箱、锅、刀具等。

实验设计采用L4(23)进行正交试验，以木瓜蛋白酶、复合磷酸盐、腌制时间作为影响因素，探讨这3种因素对腊牛肉嫩度的影响。

配方设计采用三因素两水平的正交试验设计表。

工艺流程。

牛肉一清洗一整理一配料一腌制一烘烤一检验一成品实验人员南宁东恒华道技术员小李工艺要点1、整理将牛肉洗净后，剃除筋腱、筋膜、肥膘，为了方便测定嫩度时取样，按直丝分割成0.5 kg 左右的肉块，尽量做到整齐、大小一致。

木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。

（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。

二、原理木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。

它也具有脂酶活力。

其分子量约为 23000 左右。

在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。

木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。

酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。

吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。

三、实验材料番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝四、仪器设备（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 2 ） 752 紫外分光光度计（ 3 ）水浴箱（ 4 ）冰箱（ 5 ）榨汁机五、玻璃器皿（以组为单位）试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤（一）酪氨酸的标准曲线将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：（二）粗酶活测定1 试剂（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液2 方法量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。

实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。

是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。

现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。

木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。

它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。

有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。

有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。

使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。

高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。

硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告实验报告：木瓜蛋白酶的提取纯化摘要：本实验旨在提取和纯化木瓜蛋白酶。

首先将木瓜果肉和磷酸盐缓冲液混合，经过搅拌、离心和滤过将悬浮液收集。

然后使用硫酸铵沉淀法对混合液进行蛋白质沉淀，再经过柱层析纯化得到木瓜蛋白酶。

通过测定酶活，纯化程度和回收率，验证提取和纯化方法的有效性。

结果表明，经过提取纯化的木瓜蛋白酶具有较高的纯化程度和酶活，回收率较高。

1.引言木瓜蛋白酶是一种广泛存在于木瓜中的蛋白酶，具有广谱的活性，可以降解多种蛋白质。

因此，木瓜蛋白酶在食品、制药等工业中具有广泛的应用价值。

本实验旨在研究提取和纯化木瓜蛋白酶的方法，为其进一步应用奠定基础。

2.材料与方法2.1材料：-木瓜果肉-磷酸盐缓冲液-硫酸铵-超滤膜-柱层析填料2.2方法：1)将木瓜果肉剁碎后加入磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀。

2)将混合液经过离心，收集上清液。

3)对上清液进行反复滤过，去除颗粒杂质。

4)将上清液与硫酸铵混合，使其浓度达到80%，沉淀蛋白质。

5)使用超滤膜对上清液进行浓缩，得到蛋白质浓缩液。

6)将蛋白质浓缩液加入柱层析柱，经过洗脱得到纯化酶溶液。

7)对纯化后的酶溶液进行酶活测定、纯化程度测定和回收率计算。

3.结果与讨论经过提取纯化，得到的木瓜蛋白酶具有较高的酶活。

酶活测定结果显示，提取纯化后的酶活达到了5000单位/毫升。

与未经提取纯化的酶溶液相比，酶活提高了约2倍，表明提取纯化方法可以有效提高木瓜蛋白酶的酶活。

纯化程度测定结果显示，经过柱层析纯化后，木瓜蛋白酶的纯化程度较高。

使用SDS-方法对柱层析纯化前后的样品进行分析发现，纯化后的酶样品中只存在单一的酶带，而纯化前的样品中存在多个酶带，进一步说明了提取纯化方法的有效性。

回收率计算结果显示，经过提取纯化后，木瓜蛋白酶的回收率较高。

计算结果表明，提取纯化后酶的回收率在80%以上，较未经处理的酶溶液回收率有明显提高。

综上所述，本实验通过提取和纯化方法成功得到了酶活高、纯化程度较高且回收率较高的木瓜蛋白酶样品。

木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。

2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。

3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。

4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。

4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。

在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。

临用现配。

4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。

4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。

4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。

酶的专一性实验报告酶是一种生物催化剂，它可以加速生物化学反应的速率。

酶的专一性指的是酶对某些特定底物的选择性，也就是只能催化特定类型物质的转化反应。

这种特性使得酶在工业、医药等领域有着重要应用价值。

本文将围绕酶的专一性展开实验探究。

实验过程：为了考察酶的专一性，我们选择用木瓜蛋白酶来进行实验。

在实验室准备好酶的反应物和试剂后，我们分别以木瓜蛋白酶和几种不同的底物进行反应，包括蛋白质、糖类和脂质等。

具体实验步骤如下：1. 制作反应液：将制备好的酶底物分别计量放入试管中，并加入适量的缓冲液进行混合均匀。

2. 加入酶：在反应液中依次滴加适量的木瓜蛋白酶，并用洗涤纯水进行稀释，最后在75度下进行培养。

3. 取样：依次在反应液反应后的不同时间取一定量的样品，在120度下进行灭酶，然后用试剂进行反应显色。

4. 录取结果：通过对反应液进行可视化检测，我们得到了不同底物在酶作用下的反应程度，从而得出酶的专一性。

实验结果：实验中我们得到了较为明显的结果，通过对多种底物反应的记录与观察，我们可以发现木瓜蛋白酶的专一性和活性在不同底物下的表现存在较大的差异。

在蛋白质底物下，木瓜蛋白酶表现出较为活跃的酶活性，可以使底物的反应快速进行。

而在糖类和脂质底物下，木瓜蛋白酶的活性较低，难以使底物被快速转化。

此外，我们还得到了一个有趣的发现，即在同种底物下，不同来源的酶表现出的专一性有所不同。

比如，不同生产商的木瓜蛋白酶呈现出了不同的酶活性，这说明酶的专一性是由其本身的结构性质和生产过程等多种因素共同决定的。

实验结论：通过对酶的专一性的研究，我们可以发现酶的选择性是一种非常重要的理化性质。

这种特性使酶能够在特定的反应路径中起到催化反应的作用，从而成为许多工业和生物医学领域的重要催化剂。

探究酶的专一性对于揭示酶的催化机理和优化酶的性能等都有着重要的意义。

本次实验结果表明，木瓜蛋白酶的专一性是由其本身的结构、环境因素以及反应底物的特性等多个因素共同作用的结果。

2012级生物工程《专业专题实验报告》学生姓名：覃祚树学号： 1201420122指导教师：韩国成成绩：2015年7 月17 日实验一木瓜蛋白酶的提取及定量测定（8学时）一、实验内容目的：通过对木瓜蛋白酶进行提取分离，掌握酶蛋白的一般提取方法和手段，并测定酶的得率。

原理：对木瓜进行组织破碎，过滤得粗酶液，利用酶与细胞碎片等杂质在溶剂中溶解度不同，然后通过有机溶剂法、盐析法等方法使酶蛋白聚集沉淀，然后离心过滤，进行提取分离。

二、仪器和试剂小刀、1L烧杯、组织捣碎机、抽滤机、离心机、冰箱试剂：无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、木瓜三、实验步骤细胞破碎：选取较生的木瓜，称取一定量的木瓜，切成小块，放入研浆机中加入200ml水，研匀，3层纱布过滤，弃去滤渣，抽滤，得澄清滤液即木瓜乳汁。

木瓜蛋白酶的提取纯化：木瓜乳225ml,用0.1M NaOH调pH至9.0，搅拌1h，抽滤取滤液，取50ml滤液加入75ml 无水乙醇使其乙醇浓度为60%，搅拌均匀，冰箱4℃放30min，2500r/min离心15min取沉淀，干燥得提纯品0.13g。

四、结果讨论木瓜总重=756.5g 样品木瓜重=246.2g 加水200ml 木瓜乳汁225ml木瓜中蛋白酶的总量=13.0502252.2465.756⨯⨯=1.7975g得率（%）=%100⨯木瓜总重木瓜中蛋白酶的总量=%1005.7567975.1⨯=0.238%五、总结第一天我们来到实验室，有点手忙脚乱，又说要配制试剂、配溶液，后来我们用自己的方法来提取。

我们用的是细胞捣碎，有机溶剂提取的方法，方法可行而且操作性强。

由于选的木瓜过熟，所以得量略显偏低。

实验二木瓜蛋白酶的纯化及比活力测定（8学时）实验内容一、目的：1、掌握利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定的某种有机溶剂使酶或其他杂质进行沉淀分离析出，使酶与杂质分离。

2、掌握用乙醇进行分离提纯。

3、掌握酶活测定，比活力测定。

木瓜蛋白酶实验记录2016.11.3实验前准备：所需试剂的配制：饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。

酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。

预实验：确定实验的可行性酶液提取：①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。

②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。

③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。

④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。

⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。

⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。

对静置的酶液继续处理2016．11.4试剂配制考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。

静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。

重提木瓜蛋白酶实验设置对照一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。

①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。

②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。

③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。

④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。

实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。

二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。

木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。

据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。

考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。

2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。

3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。

四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。

木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。

2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。

3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。

4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。

4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。

在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。

临用现配。

4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。

4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。

4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。