双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究

多级双水相萃取木瓜蛋白酶的研究
朱恒伟;白新鹏;梁秋杨;钟泷彬;常会敏;陈运坤;乔振栓
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2024(50)4
【摘要】使用双水相萃取大规模生产木瓜蛋白酶时,为获得较高的回收率,通常需要较高的萃取剂浓度和体积比,但这会导致目标物的纯度和浓度降低。

该研究采用聚乙二醇和柠檬酸钠组成的双水相体系在多个离心管之间的转移来模拟工业上常用的多级错流萃取和多级逆流萃取过程,以分配系数、酶活性回收率为指标,采用McCabe Thiele图解法得到多级逆流双水相萃取的理论级数,结果表明,当相比为0.5,原料液下相的木瓜蛋白酶的初始质量浓度为0.20 mg/mL时,使用3级逆流双水相萃取木瓜蛋白酶的酶活性回收率达到了96.75%,同时设计出多级逆流双水相萃取木瓜蛋白酶的优化方案。

【总页数】5页(P152-156)
【作者】朱恒伟;白新鹏;梁秋杨;钟泷彬;常会敏;陈运坤;乔振栓
【作者单位】海南大学食品科学与工程学院;热带多糖资源利用教育部工程研究中心;海口植之素生物资源研究所有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
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3.利用四丁基溴化铵—硫酸铵双水相萃取法萃取结晶紫的行为研究
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5.木瓜蛋白酶在亲和双水相系统中的分配行为及机制研究进展
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响应面法优化离子液体双水相萃取木瓜蛋白酶曾颖;朱新儒;余垒;李雄;张海德【摘要】采用1-乙基/丁基/戊基/辛基-3-甲基咪唑醋酸盐{[Cnmim]Ac(n=2,4,6,8)}与K2HPO4离子液体双水相体系对木瓜蛋白酶进行萃取分离.用浊点法测定双水相体系的双节线并采用Merchuk方程对数据进行拟合.考察各成相试剂及pH值对木瓜蛋白酶分配行为的影响,利用单因素试验和响应面法确定其离子液体双水相最佳萃取条件为:离子液体[C8mim]Ac浓度为28.03％,K2HPO4浓度为20.08％,pH值为8.55.在该条件下,分配系数可达到11.65.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2018(039)020【总页数】6页(P29-34)【关键词】木瓜蛋白酶;离子液体;双水相萃取;响应面;分配系数【作者】曾颖;朱新儒;余垒;李雄;张海德【作者单位】海南大学食品学院,海南海口570228;海南大学食品学院,海南海口570228;海南大学食品学院,海南海口570228;海南大学食品学院,海南海口570228;海南大学食品学院,海南海口570228【正文语种】中文番木瓜（Carica papaya L.）原产于墨西哥南部以及邻近的美洲中部地区。

在我国主要分布在广东、海南、广西、云南、福建、台湾等省（区）。

木瓜蛋白酶（papain）是存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内的一种低特异性蛋白水解酶，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。

木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于含巯基（-SH）肽链内切酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品[1]、医药[2]、饲料[3]、日化[4]、皮革[5]及纺织[6]等行业得到广泛应用。

木瓜蛋白酶是100%的天然物质，因此在食品及饮料工业上有独特的广阔发展前途[7]。

离子液体，又称低温熔融盐，是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐。

由于离子液体具有非常独特的理化性能，非常适合于用作分离提纯的溶剂。

木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。

-20 ℃存放。

（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。

）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。

可省略。

3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。

木瓜蛋白酶提取及在食品工业中的应用作者：韦朝英来源：《农业与技术》2018年第15期摘要：木瓜蛋白酶主要存在于未成熟番木瓜果实的乳汁中，木瓜蛋白酶同时拥有酶和蛋白酶的活性，并且特异性十分广泛，能够水解动植物蛋白和多肽、酰胺等多种物质，是一种含蔬基钛链的内切酶。

木瓜蛋白酶能够将蛋白水解物合成外类蛋白质。

未经过纯化的木瓜蛋白酶在工业中应用的比较多。

木瓜蛋白酶溶于水和油，不溶于有机溶剂。

本文主要介绍木瓜蛋白酶的提取方法和它在食品工业中的应用及效果。

关键词：木瓜蛋白酶；提取方法；食品加工；应用中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.201807320011 木瓜蛋白酶的提取方法1.1 烘干法烘干法是木瓜蛋白酶最原始的一种提取方法，是指将保护剂放入番木瓜浆液中，然后再将浆液做离心处理，之后将提取出来的上清液放在鼓风干燥箱中，将温度设置为55～60℃进行烘干处理，将其粉碎后可达到粗酶制品。

但这种提取方法不利于保持酶的活性，制作出来的酶纯度也不高[1]。

1.2 单宁沉淀法单宁沉淀法是将番木瓜的浆液进行离心处理之后，提取出上清液，之后再上清液中加入单宁溶液，同时对这种混合液进行不断的搅拌，使单宁溶液达到所需要的浓度，之后将其静置一段时间，提取出这种混合液体的复合物，对复合物的pH值进行调节，沉淀后对其进行干燥和真空处理，从而获得酶制品。

但有研究发现，这种提取方式得到的酶虽然活力较高，但得率低，且对环境也造成一定的污染[2]。

1.3 超滤法超滤技术分离木瓜蛋白酶，首先清洗干净空纤维超滤膜，控制压力和流量在要求的范围之内便可以进行过滤处理。

木瓜蛋白酶的分子较大，因此对木瓜粉蛋白酶进行超滤时会截留其中的大分子物质，只留下部分分子较小的物质和水分，实现了分离和纯化。

这种方法提取出的木瓜蛋白酶纯度高，但是由于大分子物质在超滤时会在膜表面聚集产生强烈的浓度差异，进而降低超滤速度，造成得率下降[3]。

双水相萃取技术在生物提取中的应用研究进展祝秀芬;李娜;祝子坪【摘要】The principle of aqueous two-phase extraction technology principle and the factors affecting the aqueous two-phase partition coefficient were introduced. The research and application of aqueous two-phase system in extraction of enzymes, antibiotics and other compounds were reviewed. The application prospect was also forecasted.%文中主要介绍了双水相技术的原理及影响双水相分配系数的因素,综述了双水相技术在萃取酶类、抗生素以及其他化合物方面的研究和应用,并展望了双水相技术的应用前景.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)035【总页数】4页(P17031-17034)【关键词】双水相技术;萃取酶类;抗生素;应用进展【作者】祝秀芬;李娜;祝子坪【作者单位】台州学院生命科学学院,浙江台州318000;台州学院生命科学学院,浙江台州318000;台州学院生命科学学院,浙江台州318000【正文语种】中文【中图分类】S188双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。

生物分离常用的双水相体系有2类:聚合物/聚合物/水和聚合物/盐/水，这主要是因为它们中的聚合物能使生物大分子保持稳定。

双水相萃取与水－有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配原理，不同之处在于萃取体系的性质差异。

当生物物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上下相中的浓度不同(即分配系数K不同）。

木瓜蛋白酶：一种高效水解酶的应用与研究现状作者：王远锏来源：《科技创新导报》2019年第17期摘 ; 要：木瓜蛋白酶是一种来自于番木瓜的低特异性水解酶，在食品、日用品、药物开发等领域均有着广泛应用，目前高效提取木瓜蛋白酶的手段为双水相萃取法，并通过不同的手段修饰或固定化酶分子，由此提高木瓜蛋白酶的催化效率，使木瓜蛋白酶在工业化生产上有了更加巨大的应用潜力。

外一些醇类溶剂对酶活性有不同影响，如正丙醇、丙二醇可以提高木瓜蛋白酶活性，丙三醇、乙二醇会抑制酶活性表达。

关键词：木瓜蛋白酶 ;双水相萃取 ;固定化酶中图分类号：Q556.9 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; 文献标识码：A ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;文章编号：1674-098X（2019）06（b）-0244-021 ;木瓜蛋白酶的来源与应用木瓜蛋白酶是一种来自于热带番木瓜蛋白水解酶，由两个大小大致相等但构象完全不同的亚基组成，半胱氨酸位于其活性中心，作用特异性较低，可以水解多种氨基酸羧基形成的肽键。

本身具有较高的热稳定性，目前木瓜蛋白酶在食品加工、日用品制造、生物活性物质的提取上应用较广。

在食品加工与生产上，木瓜蛋白酶能降解肌原纤维和结缔组织，断裂筋腱和肌丝，提高肉制品的软嫩度，改良口感，也可用于提取一些非蛋白类物质，常见的包括在禽类肉制品加工[1]、三文鱼鱼皮油的提取[2]等;在日用品生产上木瓜蛋白酶可将交联程度较大高分子蛋白降解成为交联程度低小分子蛋白，如蚕丝丝胶的加工[3]、丝素蛋白的加工[4]等;在药品以及具有生物活性物质生产领域，木瓜蛋白酶可以单独或联合其他酶类对原料进行降解，以便提取出大量非蛋白类及小分子蛋白物质，主要应用包括如对硫酸软骨素[5]、鹿皮多糖[6]、肝素[7]的提取与加工等，这些物质在国内都具有很大的需求，经济效益可见一斑。

2 ;木瓜蛋白酶的提取工艺与作用效果的提高传统手段的木瓜蛋白酶提取手段包括烘干法、使用盐沉淀法、超滤法等，这些手法操作简单，但是容易在提取过程中对于酶结构造成较大破坏，同时极易混入影响酶活性的杂质，进而影响产品质量，故而不适用于木瓜蛋白酶在工业生产上的大规模开发与应用。

木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展赵电波，陈茜，张丽尧(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002)摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶的组成，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。

关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用Progress of Extraction and Application of Technology of PapainZHAO Dianbo, CHEN Xi, ZHANG Liyao（College of Food and Biotechnology Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, HenanZhengzhou 450002, P. R. China）Abstract: The composition of papain was described, and its extraction methods, research of extractiontechnology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing itwas further described, and its applicationsinpharmaceutical, chemical industry and the future prospects offood processing have been prospected in this article.Key words:papain;extractiontechnology; food processing; application中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：1001-8123(2010)11-0019-05木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

PEG/(NH4)2SO4双水相相平衡数据的关联及木瓜蛋白酶在该体系中分配模型的建立董安华，彭健，许英豪，王伟涛，蒋欣欣，张海德（海南大学食品学院，海南海口 570228）摘要：为了研究木瓜蛋白酶在双水相中的分配行为，用浊点法测定了聚乙二醇（2000、4000、6000）/硫酸铵双水相体系在298.15 K下的双节线和液液相平衡数据，采用Merchuk方程、Othmer-Tobisa方程和Bancroft方程对双节线数据、液液相平衡数据进行了关联，并建立了木瓜蛋白酶在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中的分配模型。

通过相关系数考察双水相各组分浓度与分配系数的相关度，得到分配系数的对数与上下相组分的浓度差相关度较高，提出了木瓜蛋白酶分配系数与双水相成相组分浓度差的经验关系式，木瓜蛋白酶分配系数的计算值与实验值之间的相对偏差小于10%且小于其他同类模型，表明实验建立的模型对木瓜蛋白酶在聚乙二醇（2000、4000、6000）/硫酸铵双水相体系中关联效果较好，可用于木瓜蛋白酶分配系数的计算，为双水相体系中木瓜蛋白酶酶活分配系数的工程计算和双水相萃取过程的设计提供参考。

关键词：双水相；液液相平衡；分配模型；木瓜蛋白酶文章篇号：1673-9078(2014)10-194-199 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.10.033 Correlation of PEG/(NH4)2SO4 Aqueous T wo-phase Equilibrium Dataand Modeling of Partition of PapainDONG An-hua, PENG Jian, XU Ying-hao, W ANG Wei-tao, JIANG Xin-xin, ZHANG Hai-de (College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China) Abstract:In order to investigate the partition of papain in aqueous two-phase systems, the liquid-liquid phase equilibrium data of the aqueous two-phase systems containing poly(ethylene glycol) (2000, 4000, 6000) /ammonium sulfate was measured by cloud point measurements at T=298.15 K. The experimental binodal data and liquid-liquid phase equilibrium data were correlated using the Merchuk, Othmer-Tobisa, and Bancroft equations. A model was established to describe the partition of papain in the PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system. The degree of correlation between the component concentrations and partition coefficients in different groups of the aqueous two-phase system was examined using relevant coefficients. The logarithm of the partition coefficient and the concentration difference between the two-phase components had a relatively high correlation; meanwhile, an empirical equation describing the papain partition coefficient and concentration difference between the aqueous two-phase components was developed. The mean relative deviation between the ex perimental and calculated papain partition coefficients was less than 10%, and was also less than the values from similar models. This confirmed that the established model revealed a good correlation between papain in PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase system and could be used for calculation of papain partition coefficients. The result provided references for engineering calculations of papain partition coefficients in aqueous two-phase systems and design of aqueous two-phase extraction processes.Key words: aqueous two-phase system; liquid-liquid phase equilibrium; partition model; papain木瓜蛋白酶来源于未成熟番木瓜果实的新鲜乳汁，是一种含有巯基的肽链内切酶，由212个氨基酸组成，由于其耐高温、稳定性好、水解能力强等特点收稿日期：2014-05-04基金项目：国家自然科学基金(31260401)；海南大学服务地方经济社会发展项目（HDSF201306）作者简介：董安华(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物的提取通讯作者：张海德(1970-)，男，教授，研究方向：天然产物的提取被广泛用于食品、医药等领域[1]。

亲和双水相萃取番木瓜中木瓜蛋白酶的研究的开题报告开题报告课题名称：亲和双水相萃取番木瓜中木瓜蛋白酶的研究一、研究背景及意义木瓜蛋白酶（Papain）是一种由番木瓜果实中提取得到的酶，具有广泛的应用价值。

它可以用于制药、食品加工等领域，如消化剂、蛋白酶酪蛋白胶的制备、软化面团等。

传统的木瓜蛋白酶提取方法需要使用大量有机溶剂，不仅成本高但也对环境带来负面影响。

因此，研究一种简单、高效、环保的木瓜蛋白酶提取方法，对于促进工业化生产具有重要意义。

二、研究内容及方法本研究将采用亲和双水相萃取方法，通过选择合适的双水相体系，利用亲和剂与木瓜蛋白酶的亲和性，实现对木瓜蛋白酶的纯化与提取。

具体步骤为：1. 研究不同条件下合适的双水相体系的构筑。

2. 优化可用于亲和双水相萃取的亲和剂种类、浓度等参数。

3. 纯化提取番木瓜中的木瓜蛋白酶，通过SDS-PAGE等方法鉴定提取效果。

三、预期研究成果1. 确定一种简单、高效、环保的木瓜蛋白酶提取方法。

2. 确定亲和双水相萃取中适合的双水相体系和亲和剂体系。

3. 成功纯化提取木瓜蛋白酶，提高提取效率。

四、研究工作计划及进度安排1、前期准备（2个月）对亲和双水相萃取的相关文献进行了解和综合分析；收集番木瓜，制备番木瓜的提取液；建立木瓜蛋白酶含量的测定方法，为后续的木瓜蛋白酶提取过程提供数据支持。

2、体系构筑与优化（6个月）系统地研究亲和双水相萃取中不同体系构筑和亲和剂浓度、种类等因素对提取效果的影响，确立最优条件。

3、纯化提取和鉴定（6个月）在优化的条件下进行木瓜蛋白酶的纯化提取，采用SDS-PAGE鉴定提取效果，并对纯化的木瓜蛋白酶的理化性质进行分析。

4、论文撰写（4个月）对本论文的工作进行总结和总结，撰写论文，进行答辩。

五、参考文献1. 张乃霞, 周大庆,李哲宏,等. 酵素法提取木瓜蛋白酶效率比较. 食品科技, 2003, 28(7): 155-157.2. 周望芳, 于皓, 杨键锋,等. 亲和萃取法纯化木瓜蛋白酶. 中草药, 2018, 49(24): 5977-5982.3. 胡寅, 张慧玲, 王浩,等. 木瓜酶提取工艺的研究. 食品科技, 2010, 35(6): 201-205.。