蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、 双水相萃取技术可分离和纯化蛋白
双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究
蛋白质纯化的方法选择
随着分子生物学的发展;越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术;并研制成套试剂盒;使基因克隆表达变得越来越容易..但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的;分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物;以研究其生物学作用;或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品..相对与上游工作来说;分子克隆的下游工作显得更难;蛋白纯化工作非常复杂;除了要保证纯度外;蛋白产品还必须保持其生物学活性..纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白;重复性良好..这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白..在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败;因为后者要求规模化;且在每日的应用中要有很好的重复性..本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性;以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导..
1、蛋白纯化的一般原则
蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异;利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染;而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来..每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异;利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白..蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段..粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开;由于此时样本体积大、成分杂;要求所用的树脂高容量、高流速;颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开;防止目的蛋白被降解..精细纯化阶段则需要更高的分辨率;此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来;要用更小的树脂颗粒以提高分辨率;常用离子交换柱和疏水柱;应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素..选择性树脂与目的蛋白结合的特异性;柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力;洗脱峰越窄;柱效越好..仅有好的选择性;洗脱峰太宽;蛋白照样不能有效分离..
一.分子筛（凝胶层析）
原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。
优点： 1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。
2.实验操作相对简单
3.条件温和，对蛋白活性保持率高
4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。
缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。
2. 层析柱装填困难
3.对上样量有要求
4. 测定柱效困难
5.反复使用层析柱困难
二.亲和层析
原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。
优点: 1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。
缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。
三.离子交换层析
原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。
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1 重组蛋白质的分离纯化
摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体
随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
