蛋白质层析技术PPT课件
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蛋白质层析技术
蛋白质互作分析
利用蛋白质层析技术分析蛋白质之间的相互作用，揭示生命活动 的分子机制。
蛋白质复合物分离
通过蛋白质层析技术分离蛋白质复合物，研究其结构和功能，有 助于深入了解细胞内复杂的生物过程。
药物靶点筛选
在药物研发过程中，蛋白质层析技术用于筛选药物作用的靶点， 为新药研发提供有力支持。
THANKS FOR WATCHING
荧光法需要使用荧光标记物，操作相 对复杂，成本较高。
免疫学检测法
免疫学检测法利用抗原-抗体反应的特异性，通过抗体对目标蛋 白质进行识别和检测。常用的免疫学检测法包括酶联免疫吸附 试验（ELISA）、免疫印迹和免疫沉淀等。
免疫学检测法具有高灵敏度、高特异性的优点，适用于蛋白 质的定性分析和定量分析。但该方法需要制备特异性抗体， 操作相对复杂，成本较高。
蛋白质层析技术的分类
根据固定相的不同
可分为凝胶电泳、滤纸电泳、薄层电 泳等。
根据分离机制
可分为等电点沉淀法、离子交换法、 亲和层析法等。
蛋白质层析技术的应用
01
蛋白质组学研究
用于分离和纯化蛋白质，为蛋白质 组学研究提供基础。
临床诊断
用于检测和分离疾病相关蛋白质， 辅助疾病诊断和治疗。
03
02
生物药物研发
疾病标志物检测
肿瘤标志物检测
蛋白质层析技术用于检测肿瘤标志物，辅助肿瘤的诊断和预后评 估。
感染性疾病标志物检测
通过蛋白质层析技术检测感染性疾病标志物，有助于快速诊断和指 导治疗。
代谢性疾病标志物检测
蛋白质层析技术在代谢性疾病标志物检测中也有广泛应用，如糖尿 病、肥胖症等疾病的标志物检测。
蛋白质相互作用研究
缺点
蛋白质层析技术PPT课件
2
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可;
• FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的;
• FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
54
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
的）
4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
6
聚合物机体孔的结构
27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可;
• FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的;
• FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
54
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
的）
4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
6
聚合物机体孔的结构
27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
蛋白质分离技术全ppt课件
第十节
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
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Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
而增加
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
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蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
蛋白质聚焦层析
• 不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离 子交换剂结合以前，移动之距离是不同的， 洗脱出来的先后次序是按等电点排列的
聚焦效应
• 蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列 的过程叫做聚焦效应
• pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件 • 如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析
柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速 地迁移到与它等电点相同的pH处 • 从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进 行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出
脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗 时间延长而变化的 • 当蛋白质移动至环境pH高于其pI时，蛋白质
由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交
换剂结合
蛋白质的行为
• 由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂 解吸下来
• 随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复 进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被 洗下来，从而达到了分离的目的
• 具有生物活性部分的蛋白质,通过SDS-PAGE测定其 分子量
洗脱曲线
β-乳球蛋白A型和B型的分离
• 美国一所大学应用阳离子型聚焦层析 分离A型和B型β-乳球蛋白
• A型和B型分子量都是36000，等电点 仅差
• A型等电点为型为
β-乳球蛋白A型和B型的分离
• PolyCAT A柱，上样量为的β-乳球蛋 白
1
2 3
人血清载脂蛋白CⅢ亚型的分离
• 华西医科大学基础医学院方定志等利用此方 法分离了人血清载脂蛋白CⅢ亚型
• 他们用密度梯度超速离心法,从混合人血清中 分离极低密度脂蛋白，经脱脂后再进行聚焦 层析分离其中的载脂蛋白。获得的纯品载脂 蛋白CⅢ1和CⅢ2经等电聚焦电泳均呈现一 条带
聚焦效应
• 蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列 的过程叫做聚焦效应
• pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件 • 如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析
柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速 地迁移到与它等电点相同的pH处 • 从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进 行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出
脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗 时间延长而变化的 • 当蛋白质移动至环境pH高于其pI时，蛋白质
由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交
换剂结合
蛋白质的行为
• 由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂 解吸下来
• 随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复 进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被 洗下来，从而达到了分离的目的
• 具有生物活性部分的蛋白质,通过SDS-PAGE测定其 分子量
洗脱曲线
β-乳球蛋白A型和B型的分离
• 美国一所大学应用阳离子型聚焦层析 分离A型和B型β-乳球蛋白
• A型和B型分子量都是36000，等电点 仅差
• A型等电点为型为
β-乳球蛋白A型和B型的分离
• PolyCAT A柱，上样量为的β-乳球蛋 白
1
2 3
人血清载脂蛋白CⅢ亚型的分离
• 华西医科大学基础医学院方定志等利用此方 法分离了人血清载脂蛋白CⅢ亚型
• 他们用密度梯度超速离心法,从混合人血清中 分离极低密度脂蛋白，经脱脂后再进行聚焦 层析分离其中的载脂蛋白。获得的纯品载脂 蛋白CⅢ1和CⅢ2经等电聚焦电泳均呈现一 条带
蛋白纯化层析技术和工艺放大
原理
离子交换层析基于蛋白质带电性质差 异分离蛋白质。在一定pH值下，蛋白 质带电性质不同，与离子交换剂上的 离子发生交换，从而实现分离。
应用
离子交换层析常用于分离和纯化特定 类型的蛋白质，如酶、激素和抗体等。
疏水层析
原理
疏水层析基于蛋白质疏水性差异分离蛋白质。蛋白质与疏水配体结合后，通过改变流动相的pH值或离子强度， 使蛋白质与配体间的疏水相互作用减弱而分离。
原理
层析技术基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡差异，从而实现分离。 目标蛋白与固定相的相互作用力较强，随着流动相的流动，逐渐从固定相中解 离并被收集。
常用蛋白纯化层析技术
凝胶过滤层析
利用不同大小的蛋白质分子在凝胶上 的扩散速度不同实现分离。常用凝胶 有Sepharose、Sephacryl等。
蛋白纯化层析技术的应用场景
生物药物研发
用于分离和纯化抗体、酶、蛋白质等生物药 物，提高药物的纯度和质量。
蛋白质组学研究
用于鉴定和分离蛋白质，促进蛋白质结构和 功能的研究。
细胞培养与分离
用于分离和纯化细胞中的蛋白质、细胞器等， 研究细胞内各组分的相互作用。
食品安全与质量控制
用于检测和纯化食品中的蛋白质，确保食品 的安全和质量。
标准化操作程序
制定标准化的操作程序，确保每批次 分离效果的稳定性和一致性。
流速与压力控制
采用先进的流速和压力控制系统，确 保分离过程中的稳定性和层析柱寿命。
放大效应评估
在小规模试验阶段对放大效应进行评 估，以便预测和解决大规模生产中可 能出现的问题。
05
未来展望与研究方向
新技术与新方法的发展
01
03
工艺放大技术
蛋白质的离子交换层析技术
离子交换层析技术层析（chromatography）也称为色谱，就是将混合物中各种组分分离的方法，是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。
一个层析系统都包括两相，即固定相和移动相。
当移动相流过加有样品的定相时，由于各组分在两相之间的分配比例不同，它们（各组分）就会以不同的速度移动而相互分离开来。
定相可以是固体，也可以是被固体或凝胶所支持的液体。
定相可以被装入柱中或涂成薄层、薄膜，成为层析“床”。
动相可以是气体，也可以是液体，前者称为气相层析，或者成为液相层析。
离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以待分离的样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。
如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。
在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。
当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。
纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。
反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。
溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。
反之则越少。
血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为α球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白。
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。
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2
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
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3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
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27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
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26
平台的操作（软件：知识结构）
• 经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可 近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开； 6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的 蛋白。
• 通常，要达到3000个理论塔板的分子排阻 层析柱，如用50μm的介质，流速<20cm/h （参照产品说明书）应在80cm以上至 120cm，上样<5%，一般1-2%。
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10
整体柱（monolithic column ）
• 大孔结构 平均孔径为2μm的大孔网络，允许流动相 快速通过，反压极低，从而大大降低了分 离时间。
• 中孔结构 大量孔径为13nm的“中孔”，保证了目标 分子在色谱分离过程中吸附/解吸附作用所 需的表面积，因此，整体化色谱柱可以在 高流速时保持高柱效。
.
23
样品通常特点及对后续纯化的影响
• 大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量 核酸；
• 运行层析，则蛋白浓度不应大于10 mg/ml。 • (NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白浓度1-5mg/ml.
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24
平台的操作（软件：知识结构）
• 样品处理及准备工作 • 用SDS-PAGE监测整个流程 • 富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽
6
聚合物机体孔的结构
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7
结构：典型层析介质的放大观察
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8
孔的结构可分为三种类型
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整体柱（monolithic column ）
• 概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混 合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有 制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、 具有较高的柱效和可进行快速分离等优点, 已在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用 色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了 应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、 芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物 质。
的）
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4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
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5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析
溶液中加一定浓度的盐。
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平台的操作（软件：知识结构）
• E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有 特殊原因不要使用超声破碎法。
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整体柱（monolithic column ）
• 高流速 整体化色谱柱的总孔率约80％，填料具有优越的 渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也 很低 ；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。
• 高柱效 整体化色谱柱的柱效和3.5μm粒径的颗粒型色谱 柱相当，而大大优于5μm粒径的色谱柱。并且， 整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。
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整体柱（monolithic column ）
• 目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅 胶整体柱有SilicaRODTM和 PrepRODsTM。
• 默克 整体柱 ChromolithTM
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13蛋白质纯化平台. Nhomakorabea14
纯化平台的硬件结构
• 中心设备：中压至高压层析仪 • 辅助设备：过滤装置，超滤装置，离
• 目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛， 最好此前将溶液脱盐，并在含０ .２-０.４ M NaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。
• 如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris 等含氮的缓 冲成分，减少 π-π互相作用造成的吸附.
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梯度洗脱还是分步洗脱
• 蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000 倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗 脱——阶段洗脱或连续梯度洗脱
蛋白质层析技术
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1
导言
• 生物技术有三大部分：生化分离技术； DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。 其中生化分离技术是生物技术的基础和支 柱。
• 层析是最有效的分离手段，也是最重要的 蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法， 是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。
• 基因工程下游的核心是层析。
• 层析技术的理论和实践已高度发展和完善。
心机，蛋白质电泳等
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蛋白质纯化平台的结构和组成
• 含量较高的蛋白质纯化，基本可以在 三个层析步骤中实现。
• 用目标蛋白的三个独立的物理化学性 质进行层析分离。
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几步完成纯化？
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综合考虑样品的各种性质
稳定性（PH值，活性） 疏水性 分子大小，形状。 关键辅助因子
• 关键杂质 • 产品浓度 • 引进污染物 • 产品纯度 • 单位成本 • 产量
量低强度的抽提方法。 • 通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.
低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提 （如1：4左右）；
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平台的操作（软件：知识结构）
• 无特殊理由，pH应准确控制在中性附近， 尽量用酸性buffer；
• 缓冲容量：在pKa附近 缓冲容量正比于缓 冲溶液的总浓度；
• 最好运用(NH4)2SO4沉淀，缩小体积，便 于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。 个别情形中会造成不可逆沉淀；
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设计合理的方案
• 各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步）
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• 分辨率：疏水层析<离子交换层析 • 载量： 疏水层析<离子交换层析 • 选择性：疏水层析>离子交换层析
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同样的起始样品不同的纯化方案
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通常纯化流程：选择性> 分辨率 >载量
• 目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交 换，选择性好，除核酸多糖；