病毒学检验第二章 鸡胚和动物接种技术 PPT

十三、试验报告作业
1. 用于病毒培养的系统主要有哪些？ 2. 常用的鸡胚接种方法有哪些? 3. 简要说明鸡胚的结构及各部分结构的功能。 4. 用鸡胚来进行病毒的培养要注意哪些问题? 5. 如何区分无精卵、死胚、活胚？为什么最好
选用白壳蛋？
6. 卵黄囊接种与尿囊腔接种所用鸡胚日龄各是 多少？为什么两者不一样？
• 实验结果观察：周四下午3:50 • 走之前签到，不能代签 • 实验报告选择思考题中3题作答
2.在气室接近胚体处用碘酊和酒精依次消毒
3.用钢锥穿一小孔（右图哪种接种方式较好？）
4.将注射器针头经小孔沿卵长轴方向插入0.51.0cm，注入0.1-0.2ml接种物（插入部位的选择，
胚体、对面还是两侧？如果注射器打不起去说明什么？）
5.用石蜡封孔，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并 检卵一次，24h内死亡者废弃
（一）优点
➢组织分化程度低，病毒易于增殖 ➢可选择不同的日龄和接种途径 ➢感染病毒的组织和液体中含大量病毒 ➢容易采集和处理 ➢来源充足 ➢设备和操作简便易行
（二）缺点
➢胚内可能污染细菌和病毒 沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊
髓炎病毒 ➢母源抗体 ➢许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针
十、接种途径
白鼠、大白鼠、豚鼠 ✓ 鸡胚 ✓ 组织细胞
✓ 怎么辨别公鸡母鸡？ ✓ 什么是鸡胚？（受精 还是未受精） ✓ 鸡胚如何生产？ ✓ 如何判断鸡胚是活的？
是否有血丝？
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易 于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的 组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
动物病毒学实验
病毒学实验要求
➢ 做好生物防护

一般按维持液的1％～10％(V／V)量接入。 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。
6. 病毒增殖指标与收获
细胞病变(CPE)：
(2) 真菌①污染细：念胞珠菌圆或酵缩母菌，。 如痘病毒和呼肠孤病毒等；
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 • 原代细胞(primary cell) • 细胞株(cell strain) • 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
•中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯－丙烯复合物或多聚碳酸硅 等材料制成，外径50~100µm，壁厚25~75µm，壁呈海绵状， 上面有很多微孔。
•中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有 滞留作用。
•培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高 度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度 可达60％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。

动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病毒技术
一、动物增殖病毒技术
选择动物的标准：
①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、 青壮年和健康(经临床检查、检疫)； ②对相应病毒易感，并十分敏感； ③经隔离饲养和观察检查证明健康； ④家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确， 并符合普通级实验动物标准； ⑤体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。
鸡胚卵黄囊接种法
（三）影响禽胚增殖病毒的因素
1．种蛋质量
①病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、 支原体及传染性贫血因子等。 ②母源抗体： ③抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体
2．孵化技术
①温度：37～39.5℃。传染性支气管炎病毒37℃ ②湿度：鸡胚53％～57％，水禽胚比鸡胚高5％～10％。 ③通风：氧气，二氧化碳。 ④翻蛋：
能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性 均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系
2．细胞培养方法
• 静置培养 • 转瓶培养 •悬浮培养(suspension cell culture ) •微载体培养(microcarrier cell culture) • 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) • 微囊化细胞培养
•中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯－丙烯复合物或多聚碳酸硅 等材料制成，外径50~100µm，壁厚25~75µm，壁呈海绵状， 上面有很多微孔。
•中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有 滞留作用。
•培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高 度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度 可达60％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。

实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
鸡胚结构示意图
1. 气室 8.羊水腔
2. 胚壳
9.绒毛尿囊膜
3. 卵黄囊
4. 清蛋白
5. 尿囊腔
6. 壳膜
7. 胚体
实训四 病毒的鸡胚接种技术
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 照蛋
以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及 日期气室朝上立于蛋架上。尿囊腔接种选9～12日龄的鸡 胚，接种部位可选择在气室中心或远离胚胎侧气室边缘， 避开大血管。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
实训四 病毒的鸡胚5%碘酊棉球和75%酒精棉从中央 向四周进行消毒。
• 打孔
用灭菌的锥子在事先消毒的部位打一小孔。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 接种NDV
无菌操作用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插 入气室,刺入尿囊腔，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。
• 封孔
接种病毒完成后，用熔化的石蜡将小孔封闭。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
三、方法与步骤
• 继续孵化与照胚
封孔完成后，将鸡胚置温箱中直立孵化3～7d。孵化期间，每 6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。弃去接种后24h内死亡的 鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜 （气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱 冻死（新城疫Ⅳ系疫苗株一般培养至72小时）。
实训四 病毒的鸡胚接种技术
四、病毒的收获
实训四 病毒的鸡胚接种技术
四、病毒的收获
绒毛尿囊腔接种新城疫病毒时，一般收获尿囊液和羊水。 将鸡胚取出，无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳 膜，形成直径1.5～2.0cm的开口。用灭菌镊子夹起并撕开 或用眼科剪剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管 从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。