《动物病毒学实验》课件:实验五 血清中和试验2016-04-12
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中和试验中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后,失去对易感动物的致病力的试验方法。
所属分类:免疫学概述动物受到病毒感染后,体内产生特异性中和抗体,并与相应的病毒粒子呈现特异性结合,因而阻止病毒对敏感细胞的吸附,或抑制其侵入,使病毒失去感染能力。
中和试验(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础,以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据,来判定免疫血清中和病毒的能力。
两种试验方法介绍中和试验常用的有两种方法:一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合,另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。
(一) 定血清-稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位:衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD),即经规定的途径,以不同的剂量接种试验动物,在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。
但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系,在越接近100%死亡时,对剂量的递增越不敏感。
而一般在死亡率越接近50%时,对剂量的变化越敏感,故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位,即经规定的途径,以不同的剂量接种试验动物,在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。
用鸡胚测定时,毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。
用细胞培养测定时,用组织细胞半数感染量(TCID50)。
在测定疫苗的免疫性能时,则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。
(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。
测定方法:将接种病毒,并已发病濒死的小鼠,无菌法取脑组织,称重、加稀释液充分研磨,配制成10-1悬液,3 000r/min离心20分钟,取上清液,以10倍递次稀释成10、10、10……10,每个稀释度分别接种5只小鼠,每只脑内注射0.03ml,逐日观察记录各组的死亡数。
本例高于50%病毒稀释度的对数-6,距离比例为0.5,称释系数的对数为-1。
中和试验根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学实验称为中和试验。
中和试验极为特异性和敏感,主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫性的评价、免疫血清的质量评价和测定动物血清抗体的检测等。
中和试验的基本过程是,先将抗血清与病毒混合,经适当时间作用。
然后接种于宿主系统检测混合液中的病毒感染力。
宿主系统可以是鸡胚、动物或细胞培养,根据病毒性质而定,目前大多采用细胞中和试验。
最后根据其产生的保护效果差异,可判断该病毒释放已被中和,并根据一定的方法计算出中和的程度(中和指数),即代表抗体的效价。
根据测定方法的不同,中和试验主要有两种。
一是测定能使动物或细胞死亡数目减少至50%(半数保护率,PD50)血清稀释度,即终点法中和实验。
二是测定是病毒在细胞上形成的空斑数目减少至50%时的血清稀释度,即空斑减少法中和试验。
毒素和抗毒素亦可进行中和试验,其方法与病毒的中和试验基本相同。
终点法中和试验本法是滴定使病毒感染力减少至50%的血清中和效价或中和指数。
有固定病毒稀释血清及固定血清稀释病毒两种滴定方法。
固定病毒稀释血清法将抑制的病毒量固定,血清作倍比稀释,常用于测定抗血清的中和抗体效价。
病毒的毒价测定毒力或毒价单位过去多用最小致死量(MLD),即病毒接种实验动物后在一定时间内全部致死的最小病毒剂量。
此法比较简单,但由于剂量递增与死亡率递增的关系不是一条直线,而是呈S形曲线,在愈接近100%死亡时,对剂量的递增愈不敏感。
而死亡率愈接近50%时,剂量与死亡率呈直线关系,故现基本上采用半数致死量(LD50)表示毒价单位。
而且LD50的计算应用了统计学方法,减少了个体差异的影响,因此比较正确。
以感染发病作为指标的,可用半数感染量(ID50);以体温反应作指标者,可用半数反应量(RD50)。
用鸡胚测定时,可用鸡胚的半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50);在细胞培养上测定时,则用组织培养半数感染量(TCID50)。
《动物病毒学》实验课讲稿任课教师:方六荣讲课对象:2002级动物医学专业1-4班讲课时刻:2004.09-2005.01目录实验一鸡胚接种 (1)实验二传代细胞培育与病毒在传代细胞中的培育 (6)实验三原代细胞培育 (9)实验四病毒TCID50的测定 (11)实验五中和实验 (13)实验一鸡胚接种一、实验目的了解鸡胚的大体结构与功能及鸡胚接种的方式,把握经常使用的鸡胚接种方式。
二、鸡胚接种的作用要紧用于:①分离病毒,并依照病变初步鉴定病毒②培育病毒,制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系(用鸡胚作中和实验和交叉爱惜实验)④测定病毒毒力三、材料1、鸡胚10日龄2、病毒鸡传染性支气管炎病毒(IBV)3、照蛋灯4、打孔器5、石蜡6、注射器7、蛋座8、酒精棉球、碘酊棉球四、鸡胚用于病毒培育的优缺点(一)优势1、组织分化程度低2、可选择不同的日龄和接种途径3、病毒易于增殖4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒5、容易搜集和处置6、来源充沛7、设备和操作简便易行(二)缺点1、胚内可能污染细菌和病毒沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒2、母源抗体3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针五、鸡胚的结构与功能1、卵壳上有细孔,进行气体互换2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行互换。
3、气室呼吸和调剂压力4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能,氧气的互换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。
5、尿囊腔胚胎的排泄器官,内含有尿囊液,初为透明液体,是单纯生理盐溶液,以后尿囊液中尿酸盐迅速增加,胚胎发育到第12-13天后,尿囊液开始变得混浊。
6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水,胎体浸泡于其中7、卵黄在胚胎发育初期供给鸡胚营养。
8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。
六、受精卵的选择1、最好是来自SPF鸡群,以降低母源抗体的阻碍。
2、受精卵的壳最好是白色的,以便于检卵。
3、受精卵必需新鲜,保留在5-20℃不要超过10天,保留一个月的受精卵,孵化率快要于零。