新型隐球菌抗原成分的分离与纯化

隐球菌抗原成分的分离与纯化Karen L. Wozniak and Stuart M. LevitzDepartment of Medicine, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA（翻译自NCBI的文献：solation and Purification of Antigenic Components of Cryptococcus）摘要细胞壁内包裹着荚膜的真菌属病原体致病菌——新型隐球菌和隐球菌是能够通过感染显著威胁人的生命，尤其是它能够抑制人体的细胞免疫系统。

这篇文章提供了分离纯化新型隐球菌的两类主要抗原组分——荚膜多糖（葡萄糖醛酸毗喃甘露聚糖）和甘露糖蛋白的详细方法。

荚膜多糖（GXM）是多糖外壳的最初化合物，它是隐球菌的主要毒性因子。

而相反的是，甘露糖蛋白类被证明是可以引起T细胞反应的主要的抗原。

分离纯化荚膜多糖和甘露糖蛋白能够帮助研究者们研究隐球菌属的抗原、生物化学性质和毒性性质。

关键词隐球菌; 荚膜多糖; 甘露糖蛋白1. 引言新型隐球菌是真菌的病原体，它特别是能够引起T细胞功能低下的人产生疾病。

获得性免疫缺陷综合症、恶性淋巴增殖性疾病、长期使用降低移植排斥反应的免疫抑制类药物等，是引起隐球菌病主要的风险因子。

隐球菌按血清型分为A-D四类，这种分类方式是建立在它主要包膜，荚膜多糖结构的基础上。

血清型为B和C的隐球菌在以前被分类为多样的隐球菌，然而在最近被分为新的种类——新生隐球酵母变种。

新型隐球菌可以从全球的环境资源中（尤其是包含了鸟类排泄物和腐烂植物的土壤中）分离得到。

与新型隐球菌不同，虽然在加拿大的温哥华岛也出现过新生隐球酵母变种大量聚集被发现，但是新生隐球酵母变种大多数还是在热带和亚热带地区被发现的。

新生隐球酵母变种的栖息环境包括桉树和道格拉斯冷杉树。

对于隐球菌的两个种类来说，它们是通过雾气的形式被吸入有机体引起有机体感染的。

新型隐球菌的荚膜被证明是它的主要毒性因子。

它主要由荚膜多糖组成，同时也包括甘露糖蛋白。

这种荚膜能够抑制吞噬作用，同时它还能够从隐球菌细胞里面流出来进入血液、脑脊液之中，也能感染组织。

在一个实验模型中，荚膜从隐球菌中流出，荚膜多糖聚集到脾脏边缘区巨噬细胞中和肝脏的可扑弗氏细胞中。

在遭受隐球菌病的病人中，经过几个月或者几年时间的成功抗真菌治疗，荚膜多糖在血液和脑脊液积累到较高的浓度就可以被检测到。

荚膜多糖有许多免疫调节的特征。

它能够抑制人体单核细胞分泌调节炎症的细胞因子、抑制白细胞游走出、影响嗜中性粒细胞的抵抗隐球菌的活动和减弱T细胞的反应。

荚膜多糖被免疫细胞上的许多受体所识别，包括CD14、CD11/CD18、TLR2和TLR4，它还能被吸收进单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。

荚膜多糖在人类单核细胞来源的巨噬细胞里面的积累，不但会导致人体嗜中性粒细胞抗隐球菌活性下降而且还能调节MHC II（第二类主要组织相容性复合物）和刺激MDM类基因的表达。

进来的研究还显示人和小鼠的树突细胞都可以使试管内的荚膜多糖内在化。

然而在检查MHC I、MHC II,、CD40和CD86的Marker 时发现可溶性的荚膜多糖并没有阻止人类树突细胞的成熟。

来自新型隐球菌和新生隐球酵母变种的荚膜多糖直接抑制T细胞的增殖，而不影响树突细胞、巨噬细胞的抗原的表达，也不抑制T细胞的活化。

对于隐球菌的感染是需要一个适应的TH-1型免疫反应来与它抗衡从而保护机体的。

保护性抗原的研究从Bennett和他的同事们发现隐球菌的皮肤测试抗原引起了延迟性过敏反应那时候开始，研究得以继续是因为Murphy和他的同事们从天然培养的上层清液中分离了到了新型隐球菌并用它刺激老鼠引起迟发型过敏反应和细胞因子增加。

在用刀豆凝集素A 亲和吸附柱分离培养上层清液中的新型隐球菌之后，粘附的甘露糖蛋白部分被发现与迟发性过敏反应有关。

自从那个发现起，临床研究和实验研究都证明隐球菌的甘露糖蛋白是刺激T 细胞反应的关键抗原。

临床上，从隐球菌病中康复的患者体内，甘露糖蛋白能刺激淋巴组织增生反应和细胞因子释放。

实验上，在人类单核细胞和小数巨噬细胞中，甘露糖蛋白被证明能够诱导细胞因子TNF-α 、IL-12、IFN-γ的产生，这三种细胞因子对于患隐球菌病的小鼠宿主的抵抗作用是非常重要的。

此外，在一个被感染的小鼠模型中，接种了甘露糖蛋白疫苗小鼠相比于没有接种疫苗的小鼠，它们大脑中的TNF-α、IL-2、IFN-γ被提高了，免疫细胞渗透物进入大脑、肾脏和肝脏的数量被增多了，它们能够对抗新型隐球菌，因此它们的存活率提高了。

然而，大多数的甘露糖蛋白提高促进炎症细胞因子的释放，一小部分被称为MP-4的甘露糖蛋白，被证明是抑制中性粒细胞迁移，降低嗜中性粒细胞调解L的表达。

使中性粒细胞对趋化因子变得不敏感。

这篇文献提供了分离荚膜多糖和甘露糖蛋白的详细方法。

分离荚膜多糖方法的描述，能够被应用到所有菌株和按血清型分类的新型隐球菌和新生隐球酵母变种。

分离甘露糖蛋白的描述，能够被应用到相对分子质量大于10kDa的甘露糖蛋白的分离，这种方法也可以简单地修改一下就可以用来分离低分子质量的甘露糖蛋白。

此外，甘露糖蛋白的分离方法也可以用来执行分离其他抗原化合物。

2. 材料2.1荚膜多糖的准备1、在葡萄糖琼脂平板培养基（Remel, Lenexa, KS）上培养新型隐球菌。

2、10×YBN：有氨基酸的酵母氮源（Difco, Detroit, MI）6.7g 、葡萄糖（D-葡萄糖）5.0g 用dH2O配成100mL。

用0.22μm的虑瓶进行无菌过滤，保存在4℃的条件下。

在使用之前用来自纯净系统的dH2O进行稀释1倍，加入青霉素（50U/mL）和链霉素（50U/mL）。

3、醋酸钠（粉末）和乙酸（调节溶解pH）。

4、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），在室温下做一个0.3%（W/V）的在水中的浓度。

5、乙醇。

6、石碳酸、葡萄糖、硫酸、玻璃试管、96良好的底部为U形的盘子（用来进行多糖浓度化验）。

7、2M NaCl。

8、1M NaCl。

9、可以加热的玻璃器皿、无菌的乳胶手套、毫微纯净的水。

10、鲎的变形细胞溶菌产物化验（Associates of Cape Cod, East Falmouth, MA）2.2、甘露糖蛋白的准备1、酵母氮源方法（在2.1部分中描述有）。

2、过滤掉新型隐球菌包膜的帽子67（ATTC no. 52817）生长在葡萄糖琼脂培养基平板。

3、0.45μm的虑瓶和0.22微米的虑瓶（Corning, Lowell, MA）。

4、相切的过滤盒子10000MV （Millipore, catalog no. CDUF001LG, Billerica, MA）。

5、软管泵（Manostat, division of Barnant Company, Barrington, IL model 72-310-000）。

6、杜伯克产的磷酸盐缓冲液（DPBS）含有Ca2+和Mg2+。

7、刀豆凝集素A固定在4%交联琼脂糖（凝胶）凝成珠状（Sigma, St. Louis, MO）。

8、0.2M 甲基-α-D 甘露-吡喃糖（Sigma）。

9、滑动电解剂透析试剂盒（10,000 MW cutoff)）（Pierce, Rockford, IL）。

10、BCA蛋白质定量试剂盒（Pierce）。

11、SDS胶（12%）考马斯亮蓝，凝胶的蓝色着色剂（Pierce），蛋白银染试剂盒（Biorad,Hercules, CA），高碘酸-希夫染色剂（PAS）。

3. 方法荚膜多糖是主要的多糖，它由新型隐球菌的包膜和上述所提到的那些东西组成，它有许多免疫调节的作用。

这些免疫调节作用特性使得荚膜多糖成为一个可用于检测免疫反应的有用的工具。

也存在其他从新型隐球菌中分离荚膜多糖的方法，但是这个方法在这方面的描述总结了我们的实验室经常用获得纯净的荚膜多糖的方法。

荚膜多糖可以从所有按血清型分类的新型隐球菌和新生隐球酵母变种（从A型到D型）。

它们之间的不同在于荚膜多糖的结构对于毒性、嗜中性粒细胞迁移的抑制和荚膜多糖在组织内的积累量不同。

因为有这些不同，从不同种类中分离荚膜多糖可能会有不同程度的免疫调节。

甘露糖蛋白是从新型隐球菌中分离的主要T细胞抗原决定因素。

甘露糖蛋白是同时含有N-连接的多聚糖和O-连接的多聚糖的蛋白，它能够被抗原呈递细胞上的甘露糖受体所识别，它们结合能够引起抗原的有效摄取、处理，最终传递到T细胞。

它们很容易从新型隐球菌的无被膜突变株的帽子67中纯化得到，因为这种突变株在其表面上没有荚膜多糖来干扰甘露糖蛋白的纯化。

然而，其他实验室也成功地从其他不同的菌株中分离得到了甘露糖蛋白，其中就包括有包膜的菌株B3501和184-A。

和其他没有包膜的菌株，如菌株602。

在这篇文献里介绍的甘露糖蛋白的分离方法可以用来分离总的甘露糖蛋白，而不是各个单独的甘露糖蛋白。

此外，分级分离总甘露糖蛋白对于纯化来说是必须的，对于纯化各个甘露糖蛋白说也是必须的。

这些都能够通过运用标准技术得以完成，包括凝胶排阻色谱、离子交换色谱法、疏水作用色谱法和从切下的凝胶中洗脱。

甘露糖蛋白也能够通过建立在甲基α-D甘露-吡喃糖苷的摩尔浓度的分级分离方法，将它从刀豆素A玻璃粉上洗脱下来。

一旦纯化完成，甘露糖蛋白（无论是总甘露糖蛋白还是特殊个体的甘露糖蛋白）就是能够抗击隐球菌病疫苗的化合物。

此外，因为甘露糖蛋白被树状细胞和巨噬细胞上的甘露糖受体有效地长期占用，它们可以被用来在试管里研究细胞因子产生、抗原呈递、T细胞活化作用等。

最后，甘露糖蛋白的生化特性可以用来进行如酶活性等的作用分析和研究。

3.1、荚膜多糖的分离1、接种一个生长在葡萄糖琼脂培养基平板上的新型隐球菌的菌落到1L 酵母氮源培养基上进行培养，30℃下振荡过夜。

2、减慢新型隐球菌的旋转，使球状真菌沉淀。

弃掉球状真菌保留上清液。

3、通过慢慢加入醋酸钠（加粉末状）沉淀上清液中的多聚糖，使得溶液10%（W/V）。

如果醋酸钠加多了就用一支搅拌棒取醋酸进行pH调节，使pH=7.0。

加入2.5倍体积的无水乙醇，一个像艺术奶酪形状的沉淀物将会在顶部形成。

4、让溶液在工作台上停留过夜。

同时多糖就会停留在底部形成一个光滑面。

轻轻倒出上层清液，翻转烧瓶这时无水乙醇被完全移除，风干。

将多糖溶解在2或3mL dH2O中。

这就是荚膜多糖和荚膜甘露糖。

5、用杜伯斯石碳酸硫磺方法来测量多糖的浓度。

首先，制作一个标准曲线：添加1g 葡萄糖到100mLdH2O溶液中。

建立六根试管来做标准曲线。

在每支试管中加入2mLdH2O、50μL石碳酸、分别加入0、5、10、20、40、80μL葡萄糖溶液在这六支试管中。