美味牛肝菌胞外多糖的发酵条件研究_邓百万

美味牛肝菌胞外多糖的发酵条件研究*

邓百万󰀁陈文强

(陕西理工学院陕西省资源生物重点实验室,汉中,723001)

摘󰀁要󰀁对美味牛肝菌(BoletusedulisBull)胞外多糖的发酵条件进行了优化筛选。结果表明,美味牛肝菌发酵生产胞外多糖的最适碳源是蔗糖,氮源是豆饼粉;液体发酵的优化培养基是马铃薯10%,蔗糖2󰀁0%,豆饼粉0󰀁6%,KH2PO40󰀁3%,MgSO4󰀁7H2O0󰀁2%,CaCO30󰀁2%;液体发酵的优化条件是初始pH5󰀁4~5󰀁8,振荡速度180~220r/min,培养温度28󰀁,装液量60%(V/V)。将菌株放大至7L罐发酵培养,28󰀁发酵90h,胞外多糖得率是3󰀁284g/L。关键词󰀁美味牛肝菌,液态发酵,胞外多糖

󰀁第一作者:硕士,副教授。*陕西省教育厅专项科研基金资助项目󰀁食用菌优势栽培技术研究󰀁(99JK109)部分内容󰀁收稿日期:2005-04-07,改回日期:2005-07-20󰀁󰀁美味牛肝菌(Boletusedulis)俗称大脚菇,菌盖扁

平球形,子实体单生或群生,常与栎树和松树的树根形成菌根[1],是一种优质的食用菌,也是一种药用真

菌。据报道,美味牛肝菌含有20多种氨基酸,其中有

人体必需的异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸等多种氨基酸,多种维生素和矿物质、多糖,具有协调内分

泌、神经系统、提高人体免疫力以及显著的抗癌作

用[1~3]。该菌子实体的水提取活性物质(多糖),对小白鼠肉瘤5-180的抑制率为100%,对艾氏瘤的抑

制率为90%[4]。美味牛肝菌为菌根菌,目前仍不能

进行人工栽培,液体发酵生产胞外多糖也未见报道。本文对美味牛肝菌液体生产胞外多糖的发酵条件进

行了研究。

1󰀁材料与方法

1󰀁1󰀁材󰀁料

1󰀁1󰀁1󰀁供试菌种美味牛肝菌(Boletuseduls)由陕西省资源生物重

点实验室食药用菌种保藏中心提供。

1󰀁1󰀁2󰀁培养基母种培养基:CPDA培养基(马铃薯20%,葡萄

糖2%,KH2PO40󰀁5%,MgSO4󰀁7H2O0󰀁3%,VB10󰀁001%,琼脂2%,pH自然);基础培养基1:马铃薯

10%,酵母粉0󰀁2%,KH2PO40󰀁3%,MgSO4󰀁7H2O0󰀁15%,CaCO30󰀁2%;基础培养基2:马铃薯10%,蔗

糖2%,KH2PO40󰀁3%,MgSO4󰀁7H2O0󰀁15%,CaCO30󰀁2%。1󰀁2󰀁方󰀁法

1󰀁2󰀁1󰀁菌种活化

配制CPDA培养基,分装试管,121󰀁3󰀁30min

灭菌,放置斜面,接种美味牛肝菌母种,28󰀁培养,待

菌丝满管后置4󰀁保藏备用。1󰀁2󰀁2󰀁液体种制备

制备液体发酵培养基,500mL三角瓶装液量

300mL,121󰀁3󰀁30min灭菌,接活化菌种,在初始

pH5󰀁4~6󰀁0,振荡速度180r/min,培养温度28󰀁条

件下,进行液体培养。

1󰀁2󰀁3󰀁7L发酵罐的动态发酵试验

7L全自动发酵罐,pH、溶氧和温度探头,梅特勒公司;在线自动检测,上海保兴生物工程公司。接种

量10%、搅拌速度160~210r/min、通风0󰀁8vvm、温

度26~28󰀁、装液量4󰀁2L、罐压0󰀁48kg/cm2。

1󰀁2󰀁4󰀁胞外多糖的提取

收集发酵液,3500r/min离心20min,收集上清

液,浓缩,加入3倍体积的95%酒精,4󰀁沉淀48h,

3500r/min离心20min,收集粗多糖,烘干测定。

1󰀁2󰀁5󰀁菌丝干重测定

发酵后的菌丝体经离心过滤并用纯净水冲洗3

次,再用滤纸吸至不滴水,用电子天平称重。1󰀁2󰀁6󰀁多糖的测定

采用苯酚-硫酸法[5]。

1󰀁3󰀁主要仪器

BIOTECH-7BGZ全自动机械搅拌玻璃发酵罐,

THZ-82A型恒温旋转摇床,HANGPINGFA-1604型

电子天平,人工气候箱,800型医用离心机等。

2󰀁结果与分析

2󰀁1󰀁发酵培养基的筛选试验食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES

60󰀁2005Vol.31No.9(Total213)2󰀁1󰀁1󰀁不同碳源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响

在基础培养基1中,以0󰀁2%酵母粉为氮源,分

别以2%的葡萄糖、乳糖、蜂蜜、蔗糖,麦芽糖为碳源

进行多糖发酵试验,每种处理重复6次,测定不同碳源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响,见表1。表1󰀁不同碳源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响󰀁g/L

碳󰀁源葡萄糖乳糖蜂蜜蔗糖麦芽糖胞外多糖1󰀁6321󰀁1732󰀁0971󰀁8381󰀁903

󰀁󰀁表1结果表明,以蜂蜜、麦芽糖作为碳源时,胞外

多糖得率最高,分别为2󰀁097g/L和1󰀁903g/L。蔗糖、葡萄糖次之,乳糖胞外多糖得率最低。考虑到规

模化生产过程中原料的易得性及经济因素,确定蔗糖

为最佳碳源。但以蔗糖为单一碳源时,其菌体易结菌丝球,且结构较紧密,影响菌体生长和物质交换。因

此,向培养基中添加10%马铃薯可改善菌丝球的生

长,菌丝球体积明显变小,也有利于菌丝体生长和代谢过程中的物质交换。

2󰀁1󰀁2󰀁不同氮源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响

在基础培养基2中,以2%蔗糖为碳源,分别以

0󰀁2%蛋白胨、0󰀁4%豆饼粉、0󰀁4%麸皮、0󰀁2%酵母粉,0󰀁2%水解乳蛋白为氮源进行多糖发酵试验,每组

处理重复6次,测定不同氮源对美味牛肝菌胞外多糖

得率的影响,见表2。表2󰀁不同氮源对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响󰀁g/L

氮源蛋白胨豆饼粉麸皮酵母粉水解乳蛋白胞外多糖2󰀁3063󰀁7051󰀁4841󰀁5310󰀁983

󰀁󰀁表2结果表明,以豆饼粉和蛋白胨作为氮源时,

胞外多糖得率最高,分别为3󰀁705g/L和2󰀁306g/L。

酵母粉、麸皮次之,水解乳蛋白胞外多糖得率最低,仅为0󰀁983g/L。综合考虑确定豆饼粉为最佳氮源。

2󰀁1󰀁3󰀁培养基成分优化试验

以蔗糖为碳源,豆饼粉为氮源,添加10%马铃薯、KH2PO4、MgSO4󰀁7H2O,进行L9(34)正交试验,如

表3所示,结果见表4。表3󰀁正交试验因子及水平安排

因子蔗糖A豆饼粉BKH2PO4CMgSO4󰀁7H2OD水平11󰀁00󰀁40󰀁10󰀁1水平22󰀁00󰀁50󰀁20󰀁15水平33󰀁00󰀁60󰀁30󰀁2

󰀁󰀁试验结果根据极差分析,影响美味牛肝菌胞外多

糖得率的大小关系分别为C>B>A>D。各因子的

最佳水平组合是A2B3C1D3。因此确定美味牛肝菌液

体发酵生产胞外多糖的培养基配方是马铃薯10%,蔗糖2%,豆饼粉0󰀁6%,KH2PO40󰀁3%,MgSO4󰀁

7H2O0󰀁2%,CaCO30󰀁2%。

表4󰀁正交试验方差分析

试验号ABCD粗多糖含量/g󰀁L-111󰀁00󰀁40󰀁10󰀁10󰀁92521󰀁00󰀁50󰀁20󰀁20󰀁90131󰀁00󰀁60󰀁30󰀁31󰀁06842󰀁00󰀁40󰀁20󰀁30󰀁56852󰀁00󰀁50󰀁30󰀁10󰀁94262󰀁00󰀁60󰀁10󰀁22󰀁87273󰀁00󰀁40󰀁30󰀁20󰀁36583󰀁00󰀁50󰀁10󰀁32󰀁57593󰀁00󰀁60󰀁20󰀁10󰀁793k12󰀁8941󰀁5856󰀁3722󰀁660k24󰀁3824󰀁4182󰀁2624󰀁138k33󰀁7334󰀁7332󰀁3754󰀁211

2󰀁2󰀁发酵条件优化试验2󰀁2󰀁1󰀁初始pH对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响

将培养液初始pH分别调为4󰀁8、5󰀁0、5󰀁2、

5󰀁4、5󰀁6、5󰀁8、6󰀁0、6󰀁2,接活化后的斜面菌种1󰀁0cm2,静置培养24h,28󰀁,180r/min,500mL三角瓶

装液量300mL,振荡培养7d。测定pH对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响,见表4。表4󰀁pH对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响󰀁g/L

pH4󰀁85󰀁05󰀁25󰀁45󰀁65󰀁86󰀁06󰀁2胞外多糖1󰀁5131󰀁7151󰀁4102󰀁1202󰀁2782󰀁5531󰀁9121󰀁720

󰀁󰀁表4结果表明,在pH<5󰀁2和pH>6󰀁0时,美味

牛肝菌胞外多糖得率呈下降趋势。在pH5󰀁4~5󰀁8

之间,美味牛肝菌胞外多糖得率维持在较高水平。因

此,美味牛肝菌液体发酵生产胞外多糖的最适pH范围是pH5󰀁4~5󰀁8。

2󰀁2󰀁2󰀁培养温度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响

选择18、20、22、24、26、28、30、32󰀁发酵温度,接活化后的斜面菌种1󰀁0cm2,静置培养24h,在pH

5󰀁8,180r/min,500mL三角瓶装液量300mL,振荡

培养7d。测定培养温度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响,见表5。表5󰀁培养温度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响󰀁g/L

温度/󰀁1820222426283032胞外多糖1󰀁1231󰀁4892󰀁4762󰀁8732󰀁9873󰀁1342󰀁3890󰀁863󰀁󰀁表5结果表明,不同温度对美味牛肝菌胞外多糖

得率有明显的影响,胞外多糖得率在一定范围内随着

温度的升高而增长,28󰀁时胞外多糖得率达最高,为3󰀁134g/L。超过30󰀁胞外多糖得率明显下降。因

此,美味牛肝菌液体发酵生产胞外多糖的最适温度是

28󰀁。生产与科研经验2005年第31卷第9期(总第213期)61󰀁2󰀁2󰀁3󰀁振荡速度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响

选择100、120、140、160、180、200、220、240r/min

不同振荡速度,接活化后的斜面菌种1󰀁0cm2,静置

培养24h,在28󰀁,pH5󰀁8,500mL三角瓶装液量300mL,振荡培养7d。测定振荡速度对美味牛肝菌

胞外多糖得率的影响,见表6。表6󰀁振荡速度对美味牛肝菌胞外多糖得率的影响󰀁g/L

振荡速度/r󰀁min-1100120140160180200220240

胞外多糖1󰀁4721󰀁8642󰀁3692󰀁8763󰀁1873󰀁4923󰀁6843󰀁686

󰀁󰀁表6结果表明,不同振荡速度对美味牛肝菌胞外多糖得率有明显的影响。随着振荡速度的升高,美味

牛肝菌胞外多糖得率增加明显。在振荡速度<160

r/min和>200r/min时,美味牛肝菌胞外多糖得率

增加幅度较小。因此,美味牛肝菌液体发酵生产胞外多糖的最适振荡速度范围是180~220r/min。

2󰀁3󰀁7L发酵罐中美味牛肝菌胞外多糖发酵动态试

验在7L发酵罐中扩大培养,前48h内每隔12h

取样,测定溶氧、菌丝干重和多糖含量,然后每隔6h

取样测定结果。美味牛肝菌发酵过程中溶氧、pH、

菌丝干重与胞外多糖得率的动态试验结果见表7。

表7󰀁7L发酵罐中美味牛肝菌胞外多糖发酵动态试验发酵时间/h2436485460667278849096溶氧/%8861433628181671󰀁610󰀁4pH5󰀁615󰀁485󰀁275󰀁164󰀁884󰀁834󰀁604󰀁634󰀁714󰀁784󰀁90菌丝干重/g󰀁L-11󰀁163󰀁945󰀁7311󰀁3216󰀁3819󰀁2723󰀁1723󰀁4923󰀁5823󰀁6423󰀁62胞外多糖/g󰀁L-10󰀁320󰀁481󰀁291󰀁872󰀁282󰀁732󰀁983󰀁133󰀁213󰀁283󰀁17