(新)基因的原核表达

外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。

2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。

3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。

4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。

5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。

6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。

7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。

8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。

9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。

10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。

这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。

内切酶切割 特定部位
5′
真核 mRNA 的 polyA 尾巴增强了 mRNA 的 稳 定 性 ， 并 在 mRNA 从 细胞核到细胞质的跨膜转运中发 挥重要作用
5′
polyA尾巴
富含GU 序列
α α
β 3′
ω
3′
-35序列 AACTGT
TTGACA
-10序列 ATATTA
TATAAT
5′ β′ 模板链 CCGGC
基因表达与蛋白质合成
转录与翻译
制作人：江田
转录
原核生物转录区域上游序列
操纵基因：原核生物 的表达调控依赖于操 纵基因，这是与启动 子连接的一段序列， 可控制基因的转录起 始。当抑制因子附着 在操纵子上时基因关 闭，脱离后，RNA聚合 酶便接触启动子，起 始转录 正调控因子 结合区
启动子是位于结构基因5
5′
3′
α
ω α 5′
-10序列 -35序列 AACTGT TTGACA
σ亚基
T T A A T A
T A T A A T
3′ β 5′ 模板链 转录区域 非模板链 3′
β′
转录第三阶段------转录延伸
σ 因子被释放后， RNA 聚合 酶核心酶能以正确的取向与 解链后的有关单链相互作用， 形成开链复合物。核心酶催 化 RNA链延伸，这种共价延 伸 发 生 在 DNA 的 局 部 解 链 区——转录泡内
+1
八聚体盒 3′
-140 -120 -100
GC盒
-80
CAAT盒
-60
GC盒
-40 -30
TATA盒
-20
模板链 5′ 转录区域 3′ 非模板链
5′
转录第一阶段------模板的识别 原核生物

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常见的大肠杆菌表达系统
• PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启 动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或 溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产
物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在
细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之 间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞
与起始密码ATG之间的距离及碱基 的种类；防止核糖体结合位点附近 序列转录后形成发卡结构。
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表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标
基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之 间的距离和碱基组成处于一个适当的范围 内。
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核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
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尽量提高核糖体结合位点本身和附近 的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意 的事项。
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录

实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。

引物如下：引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系：2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO（“万能溶剂”） 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF（底物） 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。

称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。

（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。