高效液相色谱学习PPT培训课件

• 从 Integration 菜单选择积分或自动积分 • 选择积分工具。 • 运行一个包括数据分析的完整方法。
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自动积分
•检查开始和结束区域，确定噪音。 •赋予初始Slope Sensitivity和Height Reject值. •对第一次积分赋予一个临时峰宽值。 •设置Area Reject为0。 •执行测试性积分，有可能重复几次。 •基于较早洗脱出的色谱峰宽计算峰宽值。 •优化Slope Sensitivity和Height Reject。 •从初始的峰宽和噪音水平计算Area Reject。
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泵的辅助功能
选择Instrument More Pump Auxiliary…菜单，即 可弹出下图窗口。
在该窗口可以设置泵 的最大升流速率、泵 冲程大小以及设置溶 剂的压缩补偿因子。
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自动进样器的扩展功能
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色谱柱信息的输入
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VWD停泵扫描采集光谱
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Peak width: (半峰宽)
如果没有设置半峰宽的时间积分表，半峰宽在整个积分过程中自动变化，变化 遵从0.75×exiting peak + 0.25×current peak。
Timed Events :(时间性积分事件)
•Area Sum ON or OFF:设定某一时间段内进行峰面积加和，加和后保 留时间被分配到第一个峰的保留时间上。
使用VWD停泵扫描的功能，可以采集样品的吸收光谱， 主要操作步骤如下： 1.在Online工作站界面的View菜单下打开VWD Scans窗口； 2.按照正常的进样方式采集样品色谱数据，并保证能够在
Online Signal窗口中观测到色谱信号； 3.进样后，色谱图上出现基线时，扫描空白吸收光谱

四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。

种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
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操作过程图示
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色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
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项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
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液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
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液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
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色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
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检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。

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什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
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色谱法(Chromatography)溯源
100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色 素时采用的实验方法
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色谱法的分类示意图
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什么是HPLC？
高效液相色谱法 –HPLC(High Performance Liquid Chromatography ) –是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的 高效能分离手段: o High 高 o Performance 性能 o Liquid 液体的 o Performance 色谱
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HPLC的组成
由五大部分组成：： 溶剂输送系统（贮液器，高压泵） 进样系统（进样阀等） 分离系统（色谱柱等） 检测系统（检测器等） 记录及数据处理系统
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1. 高压输液泵
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
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安捷伦泵：小视频 色谱学堂：泵 23
在线脱气机
高效液相色谱仪流动相脱气的目的 1、使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。 2、提高保留时间和色谱峰面积的重现性。 3、防止气泡引起尖峰。 4、使基线稳定，提高信噪比。 5、降低溶剂的紫外吸收本底。 6、减少死体积。 7、防止填料氧化。
视频 ：脱气目的 在线脱气机
一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒 将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中 随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带 分离出不同的化合物 Chromato -- 颜色