高效液相色谱法培训课件
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HPLC高效液相色谱培训__PPT
HPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程 中改变流动相的组成或浓度。 高压梯度 ①线性梯度; ②阶梯梯度 低压梯度
22
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
1
Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
10
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
11
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
28
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
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Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
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Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
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Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
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Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
HPLC高效液相色谱法培训解析PPT课件
• 1．HPLC分析所用水均需纯化处理，用新鲜二次蒸馏水或蒸馏水经脱离子处理。 • 2．流动相需经过滤、脱气后方可使用。样品需经过滤或高速离心后方可进样分析。 • 3．做完实验后，反相色谱柱需用甲醇冲洗20~30 min。若流动相中含盐类或缓冲溶
液，应先配制相同比例的无盐流动相冲洗，逐渐变化到95%水溶液冲洗，再逐渐变化 到用甲醇冲洗，以保护色谱柱和高压输液泵。
48
第48页/共112页
HPLC分析基本操作
• 4．平衡：升高流速（常规分析柱一般至 1 mL/min），大约15min后，换上准备的流动相（若流动相含盐或甲醇比例较低， 中间需适当过渡），待基线走稳。
• 5．仪器面板或色谱工作站设置分析条件，如设置泵参数：工作流速、流动相比例、 高压限和低压限；设置检测器参数：如检测波长（nm）、灵敏度（AUFS）等； 编辑样品名、采集时间、进样体积等。
无法正常工作。
17
第17页/共112页
梯度洗脱装置
• 用途：梯度洗脱。 等度(isocratic)
• 高效液相洗脱方式 梯度(gradient)
低压梯度（外梯度） • 梯度洗脱方式
高压梯度（内梯度）
18
第18页/共112页
低压梯度
• 在常压下将两种或多种溶剂按一定比例输入泵前的比例阀中混合后，再用高压泵 将流动相以一定的流量输出至色谱柱。
将流动相置于超声波清 洗机中，用超声波振荡 10~30min，即可。
吹氦脱气
用在液体中比空 气中溶解度低的氦 气，以60mL／min 的流速缓缓地通过 流动相10~15min， 除去溶于流动相中 气体。
12
第12页/共112页
高压输液泵
• 是HPLC系统中最重要的部件之一。 • 输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。
液，应先配制相同比例的无盐流动相冲洗，逐渐变化到95%水溶液冲洗，再逐渐变化 到用甲醇冲洗，以保护色谱柱和高压输液泵。
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HPLC分析基本操作
• 4．平衡：升高流速（常规分析柱一般至 1 mL/min），大约15min后，换上准备的流动相（若流动相含盐或甲醇比例较低， 中间需适当过渡），待基线走稳。
• 5．仪器面板或色谱工作站设置分析条件，如设置泵参数：工作流速、流动相比例、 高压限和低压限；设置检测器参数：如检测波长（nm）、灵敏度（AUFS）等； 编辑样品名、采集时间、进样体积等。
无法正常工作。
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梯度洗脱装置
• 用途：梯度洗脱。 等度(isocratic)
• 高效液相洗脱方式 梯度(gradient)
低压梯度（外梯度） • 梯度洗脱方式
高压梯度（内梯度）
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低压梯度
• 在常压下将两种或多种溶剂按一定比例输入泵前的比例阀中混合后，再用高压泵 将流动相以一定的流量输出至色谱柱。
将流动相置于超声波清 洗机中，用超声波振荡 10~30min，即可。
吹氦脱气
用在液体中比空 气中溶解度低的氦 气，以60mL／min 的流速缓缓地通过 流动相10~15min， 除去溶于流动相中 气体。
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高压输液泵
• 是HPLC系统中最重要的部件之一。 • 输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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进样方法
整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：
不得超过定量圈体积的1/2量
高效液相色谱法培训课件
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理 论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用 高效固定相和在线检测等手段发展而成的分 离分析方法 。
与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品 预处理简单，分离效率高，流动相选择范围 广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可 回收等优点。
A
H
nm 光谱图
A-λ曲线 (定性)
min 色谱图
A-t 曲线 (定量)
蒸发光散射检测器
是通用检测器，适用于无紫外吸收的化合物。
原理：组分先引入已通气体（N2,空气 ）的 蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样 品组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射 光强度而获得组分的浓度信号。
本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度 洗脱基线稳定。
离子色谱是由经典的离子交换色谱发 展起来的一种液相色谱技术，利用物 质在离子交换柱上迁移的差异而达到 分离，用于亲水性阴阳离子的测定。 根据是否采用抑制柱，可分为抑制型 离子色谱和非抑制型离子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。
例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。 否则，部分样品将会从出口流失。这是因为 由于层流的关系，样品流经管中心的速度是 平均速度的两倍。
进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前 一针留下的样品。注射针必须清洗干净。
检测器
紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器
荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射 示差检测器 质谱
第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
输液泵
多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出， 流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸 入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不断 地输送到色谱柱中。
柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响， 泵压最高为400kg/cm2。
这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优 点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双 泵补偿法来克服这一问题。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在 整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为 假相色谱（pseudo phase
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography)
表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
废液
定量圈 1
废液
泵2
6
泵2
6
废液 5
废液 5
3
4
进样孔
柱
3
4 进样孔
柱
Load
Inject
废液出口端高度 必须与进样针在同一水平 位置，以免虹吸作用，使 样品向针筒方向回流，或 从废液口流出。
使用前后，要用流动相 （不含酸碱等缓冲液）或 甲醇或水冲洗针孔，用针 孔清洗器）。
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
pH
调性注 节的意
，： 可不流 用能动 氨含相 水缓必 、冲须 醋盐是 酸，挥 。若发
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类：
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
注意
流动相 使用前
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。
例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，
四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混
合物，含强络合剂的溶液等。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，
冲洗 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
▪进样阀
定量圈 1
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有: