His-tag 蛋白纯化磁珠-说明书

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BeaverBeads TM 金属离子螯合磁珠纯化组氨酸标签蛋白操作流程
细胞(菌体) 粗蛋白样品 重悬，裂解 + 加入Buffer A 3.目标蛋白结合 重悬后 翻转混合 30min 磁性分离
1.样品处理
2.磁珠预处理
4.磁珠洗涤
收集上清
目标蛋白量 2mg 样品体积 ~10 mL 5％磁珠悬液用量 1～2mL
产品特性
1. 基本信息
产品名称 货号 磁珠粒径范围 螯合金属离子 金属离子密度 蛋白结合量 注1 工作温度 储液浓度 保存液 保存温度 BeaverBeads Nickel 镍离子螯合磁珠 71205，71225，71275 Ni 2+ ~40 mg/mL（100％磁珠）
User Manual
BeaverBeads™ His-tag Protein Purification
海狸金属离子螯合磁珠是专为高效、快速纯化组氨酸标签蛋白而设计的一种新型功能化材料，可通过 磁性分离方式直接从生物粗样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白，极大地简化纯化工艺和提高纯化效 率，适合科研和工业领域便捷地进行组氨酸标签蛋白的纯化工作。 与传统的柱层析纯化方式相比，采用海狸磁珠纯化组氨酸标签蛋白，无需对粗蛋白样品进行多次长时 间的高速离心，也不需要过滤操作；样品与磁珠的特异性结合、洗涤和目标蛋白洗脱也变得非常简 单、快速、易操作，无需控制流速，更不需要昂贵的层析设备。对于熟练的操作者来说，在一小时内 就能获得高纯度的目标蛋白，且能轻松实现多样品平行处理，实现高通量蛋白纯化。 本产品系列包括镍离子（Nickel）、钴离子（Cobalt）和铜离子（Copper）共三种金属离子的螯合磁 珠，它们在目标蛋白载量和非特异性吸附等性能上有所区别，用户可根据目标蛋白与不同种类金属离 子的结合性能，以及对目标蛋白的产量和纯度的要求，选择不同种类的金属离子螯合磁珠。具体产品 信息和规格参考本说明书的《相关产品信息表》。
适用范围
适用于纯化细菌、酵母、昆虫和哺乳动物 细胞等分泌或胞内表达的可溶性组氨酸标 签蛋白，也可用于变性蛋白的纯化。
注意事项
1. 首 次 使 用 本 产 品 前 ， 请 务 必 详 细 阅 读 本用户手册； 2. 磁 珠 使 用 和 保 存 过 程 中 应 避 免 冷 冻 、 干燥和高速离心等操作； 3. 在 使 用 本 产 品 前 ， 请 务 必 充 分 振 荡 使 磁珠保持均匀的悬浮状态； 4. 本 产 品 可 以 重 复 使 用 ， 当 纯 化 性 能 降 低时，建议进行再生处理； 5. 本产品需与磁性分离器配套使用； 6. 本产品在2 oC～8 oC可稳定保存，保质期 两年； 7. 本产品仅供研究使用。

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操作流程
目标蛋白与金属离子螯合介质的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一 定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，研究者应该自行设计实 验，筛选出适合目标蛋白的缓冲液，包括结合缓冲液（Buffer A），洗涤缓冲液（Buffer B）和洗脱缓 冲液（Buffer C）。以下提供一个具有较强结合力的组氨酸标签蛋白的纯化流程，供用户参考。 研究者需要自备的缓冲溶液 20mM Sodium Phosphate，500mM NaCl，5~50mM Imidazole，pH7.4 Buffer A（Binding Buffer）： 20mM Sodium Phosphate，500mM NaCl，50~100mM Imidazole，pH7.4 Buffer B（Washing Buffer）： 20mM Sodium Phosphate，500mM NaCl，500mM Imidazole，pH7.4 Buffer C（Elution Buffer）： 上述缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化。在Buffer A中添加一定浓度的Imidazole可降低非特异 性结合，提高目标蛋白的结合量和纯度。初次实验，可以首先采用5～10mM Imidazole，对于较大规模的 目标蛋白纯化，研究者需要根据自行设计的预实验结果来确定缓冲液中的Imidazole浓度。另外，研究者 可根据需要在缓冲液中加入甘油和表面活性剂等成份。 研究者需要自备合适规格的磁性分离器，也可从海狸公司购买，参看本用户手册《相关产品信息表》。 1. 样品处理 本《用户手册》提供以下三种样品的处理方法： A. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Buffer A稀释，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为 1mM的PMSF）；冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中 加入适量核酸酶，在冰上放置30min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样 品进行离心操作。 B. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Buffer A稀释平衡，即为粗蛋白样品。 C. 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤一次，弃上清；用适量含1%(v/v) Triton X-100或1%(v/v) NP-40的Buffer A重悬；加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1mM的PMSF）；置于冰上 10min，即为粗蛋白样品。 2. 磁珠预处理 用户需要根据目标蛋白的表达情况确定菌体、细胞或上清液与磁珠用量的比例。下表以纯化2mg目标蛋 白的纯化为例，5％磁珠悬液用量为1～2mL。
TM
注1：蛋白结合量与目标蛋白特性相关，仅做参考值。
2. 溶剂耐受性
溶剂种类 DTE DTT 还原剂 β-mercaptoethanol TCEP Reduced Glutathione 变性剂 Urea Guanidine Hydrochlride Triton X-100 Tween 20 表面活性剂 NP-40 Cholate CHAPS Sodium Phosphate，pH 7.4 HEPES 缓冲溶液 Tris-HCl，pH 7.4 Tris-Acetate，pH 7.4 MOPS，pH 7.4 Sodium Acetate，pH 4.0 Imidazole Ethanol NaCl 其它溶液 Na 2SO 4 Glycerin EDTA Citrate 溶剂名称 可耐受浓度 5mM 5mM 20 mM 5mM 10mM 8M 6M 2% 2% 2% 2% 1% 50mM 100mM 100mM 100mM 100mM 100mM 500mM 20% 1.5M 100mM 50% 1mM 60mM 限于在蛋白样品中添加， 不可用于缓冲液。 在使用还原剂之前，请先 用无还原剂的溶液洗涤磁 珠。应避免长时间使用含有 还原剂的溶液处理磁珠。 备注
产品批号
(见瓶身标签。)

5. 目标蛋白洗脱 （1）根据研究者对目标蛋白浓度的需要，加入1～10mL Buffer C（Elution Buffer）；用移液器轻轻吹打磁 珠悬液数次，使磁珠悬浮；进行磁性分离，收集洗脱液到新的EP管中，即为纯化的目标蛋白样品； （2）如果需要，可以重复上述步骤一次，收集样品到新的离心管中，以检测是否洗脱完全。 6. 磁珠后处理 （1）在装有磁珠的离心管中加入5mL Buffer C，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重新悬浮；磁 性分离，去除上清液。 （2）在磁珠管中加入5mL去离子水（或Buffer A），用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠悬浮；磁 性分离，去除上清液。重复洗涤两次（共三次）。 （3）用Buffer A洗涤过后的磁珠可直接用于下一次蛋白纯化（建议重复使用的磁珠只用于同一种蛋白的 纯化）。若使用去离子水洗涤，磁性分离之后，移去水，加入20%（v/v）乙醇，可保存于2～8 oC。 7. 磁珠再生 磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生操作。 需要研究者制备的缓冲液： Strip Buffer：50mM Tris-HCl，500mM NaCl，100mM EDTA，pH7.4 Beads Wash Buffer（可选）：0.5M NaOH，2M NaCl Recharge Buffer：100mM NiSO 4 / CuSO 4/ CoSO 4 (此类化学试剂有一定毒性，可能造成过敏反应，使用时务必注意！) 下面以1~2mL（5%，v/v）磁珠悬液为例，详述磁珠的再生操作流程。 （1）将磁珠悬液进行磁性分离，去除上清液。 （2）加入1 mL Strip Buffer，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重新悬浮；室温旋转混合5min； 磁性分离，去除上清液；重复此步骤一次。 （3）加入1mL去离子水，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重新悬浮；磁性分离，去除上清 液；重复该步骤两次。 （4）碱洗（可选步骤）：加入1 mL Beads Wash Buffer，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重新 悬浮；室温旋转混合5min；磁性分离，去除上清液；加入1mL去离子水，用移液器轻轻吹打磁珠 悬液数次，使磁珠重新悬浮；磁性分离，去除上清液。重复去离子水洗涤步骤3～5次，至洗涤液 呈中性为止。 （5）加入1 mL Recharge Buffer，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重新悬浮；室温旋转混合 20min；磁性分离，去除上清液。 （6）加入1mL去离子水，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重新悬浮；磁性分离，去除上清 液；重复该步骤四次。 以上再生的磁珠可以加入Buffer A用于蛋白纯化实验，或加入20%（v/v）乙醇保存于2～8 oC。
TM
BeaverBeads Cobalt 钴离子螯合磁珠 71305，71325，71375 50～100μm Co 2+ 30～50 μmol/mL磁珠 ~25 mg/mL（100％磁珠） 4 oC～30 oC 5%（v/v）悬浮液 20%（v/v）乙醇 2～8 oC
TM
BeaverBeads Copper 铜离子螯合磁珠 71405，71425，71475 Cu 2+ ~30 mg/mL（100％磁珠）
（1）将海狸磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，移取1～2mL悬浮液于离心管中； （2）将离心管置于磁性分离器上，进行磁性分离，用移液器移去保存液。 （3）加入5 mL Buffer A到上述装有磁珠的离心管中，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重新悬 浮；进行磁性分离，去除上清液，备用。 3. 目标蛋白结合 将上述预处理的磁珠与粗蛋白样品混合，充分悬浮之后，置于旋转混合仪上，室温旋转混合孵育20～ 30min（ 如 果 目 标 蛋 白 含 量 较 低 或 结 合 能 力 较 弱 ， 建 议 延 长 目 标 蛋 白 与 磁 珠 孵 育 的 时 间 ， 如 延 长 到 60min）；磁性分离，移出溶液到新的离心管中以备检测，磁珠用于后续步骤。 4. 磁珠洗涤 （1）加入10mL Buffer B（Washing Buffer）到磁珠管中，用移液器轻轻吹打磁珠悬液数次，使磁珠重 新悬浮；磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测； （2）重复上述步骤1次; （3）再次加入10mL Buffer B到磁珠管，重悬磁珠后，转移至另外一个新的离心管，避免原磁珠管壁上 非特异性吸附蛋白污染目标蛋白；进行磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。