SDS-PAGE
一. 实验原理
SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的
SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材
30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃ 贮存，每过1-2个月应重新配制；
注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收， 其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存； 电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
Western Blot详细实验步骤及试剂配方
1. 溶液配置
1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）
药品用量
1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mL
SDS 0.5 g
BPB（溴酚蓝，有毒）25 mg
甘油 2.5 mL
去离子水up to 5 mL
分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）
药品用量
Tris 30.3 g
Glycine (甘氨酸) 144.2 g
SDS 10 g
ddH2O up to 1 L
室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液
（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶
Tris (MW: 121.14) 45.43 g
H2O up to 250 mL
浓盐酸调PH 8.8
（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶
Tris (MW: 121.14) 30.29 g
H2O up to 250 mL
浓盐酸调PH 6.8 二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)
SDS 10 g
ddH2O up to 100 mL
室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制
过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g
超纯水up to 1 mL
混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液
丙烯酰胺 150 g
甲叉双丙烯酰胺 4 g
Milli-Q水 30 mL
滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
【目的】
1 ． 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。
2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】
带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的
电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和
所带的电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体
和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂 过硫酸铵（
Ap ） 和加速剂 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而
制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单
体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大
小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三
重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好， 分辨率
较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，
而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是
目前较好的支持介质， 应用十分广泛。
图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原
理相同。本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同
的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在
不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区
带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。
【器材】
1 ．电泳仪
直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。
2 ．垂直管型圆盘电泳装置
目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这
第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）
SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液） 称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液） 称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至 100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液） 商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液） 称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液） 0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×） 称取三羟甲基氨基甲烷 30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至 1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×） 称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至 100mL。
