第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams等 1990；Welsh等 1990）。尽管RAPD技术诞生的时间不长，但由于其独到的DNA多态性以及快速、简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段之一。本文将对RAPD技术的基本原理和特点、基本操作程序以及RAPD技术在检测物种遗传多样性中的应用作一简单的介绍。
11.1 RAPD技术的原理和特点
RAPD技术建立在PCR技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增 DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。
RAPD所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组DNA序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的3端相距在一定长度范围之内，就可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生DNA片段的插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR产物的检测即可探知基因组 DNA在这些区域内的多态性。
进行RAPD分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组DNA多态 性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD可以 对整个基因组进行多态性检测。
RAPD技术与其他DNA多态性检测技术如RFLP（restriction fragment length polymorphism）、DNA指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD技术可以在对受试物种（包括动物、植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作简便，一次RAPD扩增实际上就是一次简单的PCR反应，适合大量样本的快速分析；③所需模板DNA量极少，一般一次扩增只需5～50ng的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA进行直接扩增。这对于珍稀濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的（王文等 1994；陈永久等 1997，1998；Gwakisa等 1994；Yi 1995；
本章作者：陈永久，魏 伟，史宪伟，张亚平
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Tibayrenc等 1993；Wachira 1995）。
11.2 RAPD的基本操作方法
RAPD的操作方法大体上包括DNA提取、扩增、电泳和染色等几个主要步骤。具体的操作过程见 Williams等（1990，1993）和 Welsh等（1990）的论述。随着 RAPD技术的发展，该技术也作了一些改动（Bucci，Menozzi 1993；Dawson等1993；Lawson等1994）。
11.2.1 RAPD模板的制备
11.2.l.1 动物组织总 DNA的提取
取新鲜动物组织材料，如肝脏、肾脏或肌肉等10～100mg，剪碎后加入750μl的STE （0.1mol／dm3NaCl，20mmol／dm3EDTA，10mmol／dm3Tris-HCl，pH值 8.0）、80μl 10％SDS 和8μl 20mg／ml的蛋白酶K。在56℃下消化12～24／小时后，用酚、氯仿、异戊醇（25:24: 1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次。每次抽提时间为12～24小时。上清液用等体积 的异丙醇沉淀及70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE溶解，置于4℃冰箱中备用。
11.2.1.2 植物及其真菌的总DNA提取
取50～500mg植物或真菌的新鲜材料，分别经95％的乙醇、70％的乙醇和超净水清洗。将材料剪碎后，在材料中加入700μl十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液（2％CTAB， 1.4mol／dm3NaCl，0.2％ 2-巯基乙醇，20mmol／dm3EDTA，100mmol／dm3Tris-HCl，pH值8.0）。在56℃下消化12～24小时。用酚、酚－氯仿－异戊醇（25:24:1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次，每次抽提时间为12～24小时。将上清液用等体积的异丙醇沉淀后，用70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE溶解，然后置于 4℃冰箱中备用。
12.2.2 RAPD反应体系
11.2.2.1 RAPD反应的仪器和试剂
用于 RAPD扩增的实验仪器主要是一台 PCR扩增仪。由于 RAPD反应中的引物和模板 之间的结合是随机的，因此我们建议使用一台固定的PCR扩增仪进行RAPD反应。
RAPD反应的试剂有：①PCR缓冲液，各家公司生产的TaqDNA酶均配有相应的缓冲液；② dNTP，包括 dATP，dGTP，dCTP和dTTP 4种，每种浓度为25mmol／dm3 ；③MgCl2 25mmol／dm3；④随机引物，美国Opren公司生产800种随机引物，其他一些公司也有生产；⑤牛血清白蛋白（BSA）10mg／ml，或明胶 0.01％；③TaqDNA聚合酶。
11.2.2.2 RAPD的PCR体系
PCR体系可以是10μl、20μl、25μl、50μl或100μl。反应体系中各成分的浓度为：①随机引物，通常为10对碱基组成，其中G＋C％为50％～70％，用于RAPD的引物浓度为0.2μmol／dm3；②dNTP（包括dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；用于RAPD反应的每种dNTP
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浓度为0.1mmol／dm3；③PCR反应缓冲液：包括10mmol／dm3Tris-HCl，pH值9.0，50mmol／ dm3 KCl，2.5mmol／dm3 MgCl2 ；④0.001％明胶（或 2mg／ml的 BSA）；⑤基因组 DNA:5～ 50ng的基因组 DNA；③TaqDNA聚合酶：0.5～1μl的 TaqDNA聚合酶；⑦矿物油：反应混
合物用适量的石蜡油覆盖，以防治反应液蒸发。
11.2.2.3 RAPD反应程序
RAPD为一种特殊的PCR技术，与常规PCR不同的是，RAPD要求的退火温度较低，这是由 于RAPD使用的引物较短所致（10bp）。通常的RAPD扩增条件是：①94℃预变性200秒；②94℃变性1分钟，36℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，包括40个循环；③72℃最后延伸300秒。
但有时PCR扩增仪的性能并不完全一致，因此RAPD反应的条件也应作相应的改变。用于 RAPD反应的 DNA必须是片段大、纯度高的基因组 DNA（Genomic DNA）。如果DNA样品混有 杂质蛋白质或PCR反应抑制剂，那么就会大大影响RAPD扩增效果（陈永久，张亚平 1997）。
11.2.2.4 RAPD产物的检测
RAPD产物可用1／4体积的溴酚蓝－EDTA－甘油混合液，采用1．5％的琼脂糖胶检测，电泳的电压小于5V／cm。最后用溴化乙锭染色，在紫外光下拍照成像。
11.3 RAPD数据的统计方法
经过DNA提取、扩增及电泳、染色过程得到了多态程度较高的RAPD谱带。目前对RAPD 数据处理还没有建立起一套诸如同工酶数据处理的较完整的统计体系。近年来一些学者在
进行RAPD研究时，提出了各种不同的资料处理方法，但很多公式都是借用同工酶或RFLP的 统计方法。国际上流行着一些RAPD数据处理的方法和程序，比较常用的是UPG-MA（无权重 配对算术平均数法），其基本原理是运用Jaccard相似系数（Anderberg 1973；Vierling， Nguyen 1992；Heun等 1994；Lawson等 1994）。与其类似的是NTSYS（数量分类系统），还有使用SAS统计分析软件包中CLUSTER程序等方法（Keil，Griffin 1994；Baruffi等1995）。
在检测不同个体和群体之间的遗传变异时，RAPD标记可看作是有用的孟德尔特征（Buc-ci，Menozzi 1993）。RAPD标记具有显／隐性，所以对于自交的种类，RAPD谱中某多态位点一般是纯合的，扩增产物的频率可以作为等位基因的频率；对于异交的种类，RAPD谱中某一多态位点可能是杂合的，扩增产物存在的频率只能作为RAPD表型频率来定义（Williams 等 1990；Caetano-Anollés 1994）。对于已知的等位基因频率，可用Nei指数来计算群体的基因多样性、遗传分化系数及遗传距离，也可用Shannon指数来估算群体的遗传多样性（Nei 1973，1975；Lewontin 1972）。但对于RAPD表型频率，则只能估算 Shannon表型多样性指数和Jaccard相似系数（距离）（Chalmers等 1992；Keil，Griffin 1994）。
采用琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色得到的带相对较少，比较易于分析。而用聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色得到的带比较多，这是因为银染比较敏感（Williams等1993；Bas-
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sam，Caetano-Anollés 1993）。虽然目前文献中用到的方法都是针对前者的，但是我们认为这些统计方法也适合于聚丙烯酰胺凝胶银染后的分析。以下介绍几种主要的RAPD数据统计方法。
11.3.1 多态位点比例和每位点平均杂合度
所谓多态位点是指其绝大多数等位基因的频率小于或等于0.99的位点。一个位点的纯合 度和杂合度分别定义为：j =∑x i2 和h= 1—∑x i2 ，x i 表示第i个等位基因的频率。平均纯合度（J）和平均杂合度（H）则是全部位点测定值的平均数。Nei（1975）认为前述关于多态位点比例的定义有些武断，平均杂合度比多态位点比例更加适合于测定基因的变异。Nei（1973）将平均杂合度H改称“基因多样性”，称平均纯合度J为“基因一致性”。
11.3.2 遗传分化指数
目前文献中应用较多的是Nei的遗传分化指数。它是由Nei（1973，1975）提出来的。 11.3.2.1 群体的基因多样性及基因分化系数（G ST）
Nei（1973）将总群体的基因多样性（H T）分解为群体内基因多样性（H S）和群体间基因多样性（D ST）：
H T = H S＋D ST ，G TS = D ST ／H T
这里 Hs = 1—Js = 1— （∑J i）／S，其中 S为群体的数目，J i = （∑X ik2）／n。这里J i是第i个群体内的基因一致性，X ik是第i个群体第K个等位基因的频率，n是i个群体的基因位点数目；H T = 1—J T = 1-［（∑X k2）／n］／S，这里X k=∑iωi X ik，ωI 是第i群体的加权（∑ω
i= 1）；D ST =（∑∑D ij ）／S 2，这里D
ij =（J i＋J j）／2—J ij ，其中J ij是第 i个和第 j个群体
间的基因一致性：J ij =（∑X ik X jk）／n。
11.3.2.2 群体间的遗传距离
Nei（1975）定义遗传距离为：
D = —log eI或D=—ln I
这里 I = J XY／（J X·J Y ）1／2。其中J X，J Y和J XY 分别是所有位点上j X、j Y 和 j XY的算术平均数。这里j x =∑X i2 ，j y =∑Y i2 ，j xy =∑X i Y i ，X i、Y i分别是X、Y群体中第i 个等位基因的频率。
Nei（1978）讨论了由少量取样个体估计平均杂合度和遗传距离的系统偏值，认为如果研究了大量的位点，且平均杂合度低，那么用于估计平均杂合度的个体数量可以很少；若是遗传距离大，且两个种的平均杂合度低，那么也可用很少的个体估测遗传距离。这就为某些情况下的少量取样提供了依据也带来了方便。
11.3.3 Shannon多样性指数
Lewontin （1972）认为，任何一个多样性测度必须具有以下特征：①当位点上没有变异，只有一个单一等位基因出现时，这个多样性的测度应该是最小的（为零）；②对一固定数量的等位基因来说，如果每个等位基因的频率相等，那么多样性测度应该是最大的；③随着不同等位基因数量的增加，多样性应该增加；④这个多样性测度应该是等位基因频率的一个con-
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vex函数。也就是说，除非两个群体在成分上是一致的，否则，从这两个群体的集合取样的个体的多样性应总是大于这两个群体多样性的平均值。比如，一个群体的两个等位基因A1和A2 的比率是0.7:0.3，其多样性应该与等位基因A1 和A2 的比率是0.3:0.7的群体的多样性是等同的，但是它们的值都应小于取自所有这两个群体个体的多样性。
Lewontin指出，Shannon信息指数就满足了以下要求：如果P K = 1，P i = 0，i ＝1，2…，K—1，K＋1，…n，H = —∑ P i log2 Pi=0；如果对所有的等位基因i，P i = 1／n，H ma x = log2n。Lewontin （1972）首先将Shannon信息指数用于估算人类种群的同工酶多态性，并认为可以应用Shannon信息指数计算植物群体内和群体间的基因多样性。King和 Schaal（1989）用 Shannon指数检测了核糖体DNA限制性位点的变异。Chalmers等（1992）则发展了这个方法，将它用于处理RAPD数据的工作中：
H =—∑P i log2P i
这里Pi是一条扩增产物存在的频率，或所谓的RAPD表型频率，H则为表型多样性指数。H可以计算两种水平的多样性：Hpop和Hsp。Hpop是群体内平均多样性的测度，Hsp是种内多样性。Hpop／Hsp则是群体内多样性所占的比例，群体间多样性所占比例为（HspHpop）／Hsp。
Chalmers等（1992）用Shannon表型多样性指数根据RAPD数据计算了一种虫媒植物Gliricidia sepium的遗传变异后发现，平均来讲，大部分的多样性存在于群体之间（60％）。但是多样性在群体间和群体内的分布随引物的不同而不同。例如，引物SC10-39检测出大部分变异存在于群体间（80％），而引物SC10-58则检测出大部分变异存在群体内（55％）。他们应用Shannon指数检测出委内瑞拉和巴拿马群体有最低水平的群体内变异，而尼加拉瓜和危地马拉群体则表现出高水平的群体内变异。然后，作者又用Nei的相似性矩阵作了补充计算，也发现委内瑞拉和巴拿马群体表现出最低水平的变异。与Shannon指数不同的是，Nei的相似性指数检测出墨西哥群体有最高水平的变异。
由于Shannon表型多样性指数只强调一条扩增带的有无，所以它对于处理异交植物的RAPD 数据可能是有用的。
Kongkiatngam等（1995）对此作了改进。假定一个多态RAPD位点上有两个等位基因，根据Hardy-Weinberg定律，RAPD隐性等位基因的频率可由缺少这条带的个体频率开平方获得。i被RAPD隐性等位基因的频率减可得显性等位基因频率，由这些等位基因频率应用Shannon 信息指数估计期望杂合度。即式中的P i 不是RAPD表型频率而是i th等位基因的频率。
11.3.4 Jaccard系数
Jaccard系数由Anderberg（1973）开始用于聚类分析。Anderberg认为，Jaccard系数是一个传统的名字，这个系数是一个有附加条件的值。对所有的变量，首先去掉0-0匹配的数据，随机获取的数据单位定量为 1。0-0匹配被认为没有关系。Keil和Griffin（1994）在区分桉属（Eucalyptus）的几个种的无性系（clone）及分株（ramets）时，借助 RAPD标记，用 Jaccard系数计算了几个无性系之间以及分株之间的遗传距离：
D ij = 1—（B ij／M ij）
其中 D ij是基因型 i和j间的遗传距离，B ij是i和j共同具有的扩增带数，M ij是i和j 的RAPD谱中所能记录扩增带的总数。D ij为0，表示没有观察到i和j的RAPD谱中有差异；D ij 等于1，表示这两个RAPD谱中没有共同的扩增带。
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11.4 应用RAPD标记时的几个问题
11.4.1 RAPD标记的重复性问题
RAPD标记是由一随机核苷酸序列的单引物扩增随机DNA片段获得的。由于扩增过程比较敏感，所以实际应用RAPD标记时，检验其重复性是很重要的。Williams等（1993）认为，模板DNA含量为lng／μl时，一般能够提高RAPD标记的重复性。基因组的大小也会影响扩增的重复性。基因小到1.5mb，扩增反应还是能够重复的，但基因组再小时（如噬菌体λ的基因组只有48.5kb），扩增的可信度就会降低。小基因组中扩增可靠性的丧失，可能是由于这些小基因组与引物之间的互补情况不良引起的。镁离子浓度和退火温度影响着扩增带的相对密度。
0.1～0.2μmol／dm3的引物浓度，100μmol／dm3的每种底物（dNTP）的浓度，以及 0.5u／25μl 扩增反应液的 TaqDNA聚合酶对于 RAPD扩增的重复性来说都是适合的。但是，Williams等指出，对大豆DNA的扩增来说，1.0u／25μl反应液的 Taq酶用量比较合适。
当然，引物的长度对RAPD扩增过程也有影响。Hadrys等（1992）指出，引物太短，不合理的片段增多，而引物太长，得到的扩增片段就太少，不足以提供足够的信息量；当引物长度超过15bp时，引物长度的增加也会引起非特异性引物退火，因而导致非重复性随机扩增的可能性增加，适合长度的引物一般为10bP。如果引物中G＋C的含量与所要分析基因组中G＋C的含量相近，就能增加扩增产物的数目。在标准的扩增条件下（Williams等1993），10个碱基引物应包含至少4个G十C碱基。对于包含5个G十C碱基的引物，其长度至少要有9个碱基才能保证有效的扩增并被溴化乙锭显色方法检测到。也有用9个碱基以下的引物进行扩增的，但这就需要更为灵敏的银染方法来显色检测扩增产物。Caetano-Anollés和Bassam （1993）的DNA放大指纹（DAF）方法使用了非常短的引物（5～8碱基），得到了有效的扩增，并被证实是稳定和可行的（Gresshoff，McKenzie 1994；胡志昂等 1997）。
Bucci和Menozzi（1993）的实验表明，适合的分辨率和可重复性需要至少10ngDNA（约337个单倍体基因组当量），当在5ngDNA（约168个单倍体基因组当量）以下时，就失去了扩增的重复性；Mg2+浓度（终浓度）为1.9～3.5mmol／dm3、Taq聚合酶（Perkin Elmercetus）0.5～l.25μl（终体积 25μl）可得到重复的结果。使用 3种不同的 DNA提取方法和2种不同温度循环仪，都能得到可比的扩增带（Bucci，Menozzi 1993）。然而，陈永久和张亚平（1997）的实验发现，不同厂家制造的PCR扩增仪、不同厂家出品的TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液、RAPD反应体系中的引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、BSA（牛血清白蛋白）或明胶，以及模板DNA的量等均可能对RAPD结果有不同程度的影响。
11.4.2 标记的显／隐性问题
RAPD标记的主要缺点是其显性本质及较低的等位基因数量，90％以上的RAPD标记是显性遗传的（Caetano-Anollés 1994）。
一条RAPD产物的存在并不能区别与之相关的位点是纯合的还是杂合的。对自交植物来说，一般不存在这个问题。而对异交植物来说，试图从一条带的存在来区分位点的杂合性和纯合性是很不现实的，所以当需要确定杂合性时，就必须要借助下列的实验手段来补充检验。
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（1）可以应用分别扩增自两个亲本的一对联系紧密的RAPD标记来区分杂合性。例如，这一对标记都扩增了，说明个体是杂合的（Williams等 1993）。
（2）用光密度测量法可以定量测定RAPD带的强度。由一个杂合区扩增的RAPD带的强度是由纯合区扩增带的一半。然而，这种定量法的可靠性需要进一步检验（Williams等 1993）。
（3）可以用二倍体植物的配子体进行RAPD研究。由于配子体是单倍的，因而就不存在 显隐性问题。更由于裸子植物种子的特殊性（种子中雌配子体组织是单倍体），因而用雌配子体作研究比较方便。例如 Bucci和 Menozzi（1993）用RAPD标记对 Picea abies的研究。
（4）也可以用F2 代RAPD标记的分离情况来确定位点的纯合或杂合。这个方法比较准 确，但对于长命植物，观察后代RAPD标记的分离需要很长周期，不像以上的方法能那么及时地得到结果。
11.4.3 限制性内切酶在RAPD研究中的应用
在扩增反应之前，用限制性内切酶消化基因组DNA可以简化RAPD谱，并且可以改变带的相对密度（Williams等1993）。在某些情况下，如果RAPD谱太复杂，可以用这个方法简
化其模式，便于解释RAPD结果。然而，Caetano-Anollés（1994）认为，扩增模板用l～3种限制性内切酶消化可以提高扩增的多态性，以利于区别大豆的近等基因系（near-isogenic lines）以及近缘的植物取样。在研究过程中，Caetano-Anollés发现，扩增前用5种限制性内切酶消化大豆 DNA，并没有降低扩增产物的数量，而用 7种内切酶消化大豆 DNA后，RAPD谱的复杂性才显著降低，这说明少许扩增子（amplicons）可能对引物-模板错配具有忍耐力。
我们在用 RAPD标记研究野大豆 Glycine soja遗传多样性时，发现检测出的多态性位点很少或没有，于是扩增产物用限制性内切酶消化后电泳，并染色检测，能取得较满意的结果（魏伟等1998）。这说明限制性酶切法是标记RAPD的研究中一种有用的方法。
11.4.4 RAPD标记和同工酶多态性分析
同工酶或等位酶已经广泛地用于遗传多样性分析。但是同工酶多态性只涉及有限的功能系统群，主要是关于基因编码序列的变异。RAPD多态性则可以发生在基因组的任何地方，包括编码的和非编码的，单拷贝和重复DNA（Bachmann 1994）。因而分别基于同工酶和RAPD的结论可能有所不同，如 Chalmers等（1992）用 RAPD标记研究了 Gliricidia sepium和G.maculata的遗传变异，得出结论说，大部分的多样性存在于种群间。Chalmers认为他们的结论与Hamrick（1990）的不同，因为后者通过同工酶分析，认为对异交的木本多年生植物来讲，大部分的变异应存在于种群内，G．sepium正是虫媒异交多年生植物。
但是，对有的植物来讲，同工酶分析的结论却与RAPD研究结果类似。Heun等（1994）在研究燕麦 Avena sterilis取样的亲缘关系时，对比了同工酶分析和RAPD标记的研究结果，发现除个别差异外，两种方法聚类和排序的结果大体上是相同的。
我们认为，同工酶方法是一种发展比较成熟的技术，并且由于它简便易行，得到了广泛的应用。所以在重视RAPD标记的同时不能够忽视同工酶分析的作用。RAPD标记可以更为准确地检测同工酶分析无法分辨的近缘样品间的关系，而同工酶方法可以作为RAPD标记的补充和验证。
肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型(一) 【关键词】肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型 摘要：目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA，建立和优化随机扩增多态性DNA(RAPD)反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增，筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用，每一菌株均可扩增出4～10条DNA片段，大多数片段在100～2000bp之间，共扩增出42条RAPD条带，其中共有条带7条，多态性条带35条，多态性为833%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在426%～100%之间，在0850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势，对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。 关键词：肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型ApplicationofRAPDinmoleculartypingSalmonellaenteritidisisolates Abstract：ObjectiveMoleculartyping12strainsoftheSalmonellaenteritidisisolatedfromdifferentorigins.Metho dsThegenomicDNAofdifferentSalmonellaenteritisstrainswereextractedandrandomamplifiedpolym orphicDNA(RAPD)systemwasdevelopedandoptimized.22randomprimersweretestedtotheanalysiso n12strainsofSalmonellaenteritisisolatedfromdifferentsources,andtheclearandconstantfingerprints wereselectedforstatisticalanalysis.Results4effectiveprimersnamedOPG-03,OPG-06,OPG-07andOP G-13wereselected,withwhicheachstraincouldbeamplified4to10DNAfragmentsof100bp～2000bp.42RAPDbandswereamplified,833%ofthembeingpolymorphic.Thecomparativeresearchoft heclusteranalysisbasedontheRAPDbandsspectrashowedthatthesimilaritycoefficientbetweentwodi fferentstrainsvariedfrom426%to100%,and12Salmonellaenteritisstrainsinthisexperimentcouldbecl assifiedto5groupsaccordingtotheirgeneticrelationship.ConclusionUsingRAPDtosubtypeandcharact erSalmonellaenteritisatmolecularlevelismorerapidandsensitivethanothertypingmethods,whichind icatebroadfutureofapplication. Keywords：Salmonellaenteritis;RAPD;type 菌株分型对肠炎沙门菌的流行病学调查，以及研究其感染和传播机制具有重要意义。随机扩增多态DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD）具有操作简便、快速、敏感及不需先了解目的基因的核酸序列等优点，目前广泛应用于微生物的分子分型和鉴定、物种亲缘关系的确定及分子流行病学等领域的研究〔1-3〕。本研究应用RAPD技术对12株不同来源的肠炎沙门菌进行分子分型，分析指纹图谱对其鉴别的价值并确定不同菌株间亲缘关系，为肠炎沙门菌食源性疾病预防控制和鉴别诊断提供新方法。结果报告如下。 1材料与方法 11材料(1)菌株与来源:12株肠炎沙门菌分别来自病人分离株4株（菌株号为SEWX01～04），生猪肉分离株2株（菌株号为SEWX05，06），熟食样品分离株1株（菌株号为SEYZ08），鸡分离株3株（菌株号为SEYZ11～13），生鸡肉分离株2株（菌株号为SENT19，20）。(2)酶与试剂:TaqDNA聚合酶,DNAMarker，dNTPs(大连宝生物工程有限公司)；溶菌酶,蛋白酶K，RNA 酶,Sarkosyl(上海申能博彩生物工程公司)；其他试剂均为国产分析纯。(3)随机引物:22条随机引物（编号为OPG-01～OPG-22）由上海申能博彩生物工程公司合成,均为10bp，经筛选用于分型的共有4条，分别为:OPG-03：5＇-AATCGGGCTG-3＇；OPG-06：5＇-CGGCCCCTGC-3＇；OPG-07：5＇-GGATCCTGAC-3＇；OPG-13：5＇-CAGCTCCTGT-3＇。 12方法 121基因组DNA提取挑取单菌落接种100ml乳糖发酵(LB)培养基，37℃震荡培养18h，4℃冷
第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用 DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams等 1990；Welsh等 1990）。尽管RAPD技术诞生的时间不长，但由于其独到的DNA多态性以及快速、简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段之一。本文将对RAPD技术的基本原理和特点、基本操作程序以及RAPD技术在检测物种遗传多样性中的应用作一简单的介绍。 11.1 RAPD技术的原理和特点 RAPD技术建立在PCR技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增 DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组DNA序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的3端相距在一定长度范围之内，就可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生DNA片段的插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR产物的检测即可探知基因组 DNA在这些区域内的多态性。 进行RAPD分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组DNA多态 性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD可以 对整个基因组进行多态性检测。 RAPD技术与其他DNA多态性检测技术如RFLP（restriction fragment length polymorphism）、DNA指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD技术可以在对受试物种（包括动物、植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作简便，一次RAPD扩增实际上就是一次简单的PCR反应，适合大量样本的快速分析；③所需模板DNA量极少，一般一次扩增只需5～50ng的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA进行直接扩增。这对于珍稀濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的（王文等 1994；陈永久等 1997，1998；Gwakisa等 1994；Yi 1995； 本章作者：陈永久，魏 伟，史宪伟，张亚平