第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用
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第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用页数:7
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分子标记与遗传图谱
分子标记与遗传图谱AFLP的原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。
限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。
选择特定的片段进行PCR扩增，由于在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3’端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3’端严格配对的片段才能得到扩增。
再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
该技术包括三个步骤： DNA被限制性内切酶切割，然后与AFLP聚核苷酸接头 adapter 连接；利用PCR方法，通过变性、退火、延伸循环，选择性扩增成套的限制性片段，经过多次循环，可使目的序列扩增到0.5～1μg；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。
利用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下，可在一次单个反应中检测到大量的片段。
由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA 谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生；这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记；所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
简单序列长度多态性 Simple Sequence Length Polymorphisms,SSLP 限制性片断长度或PCR产物长度因为小卫星或微卫星随机重复数量的变化形成的差异。
SSLP具有多等位性，有两种SSLP常用于作图：小卫星序列：又称可变串联重复，其重复单位为数十个核苷酸。
微卫星序列：或简单重复序列，其重复单位为1-6个核苷酸，由10-50个重复单位串联组成。
微卫星序列的应用比小卫星序列的应用普遍的多，原因有二：小卫星序列大多集中在染色体的端部；而微卫星序列在整个基因组中分布广密度高；微卫星序列PCR分析：PCR扩增的DNA长度少于300bp时，反应既快速又精确。
分子医学技能-生化：实验三：琼脂糖凝胶电泳及基因多态性
PCR；电泳检测
• 本实验的预期目标：通过观察电泳条带的 差异，检测来自不同样本的apoB基因的多 态性.
apoB基因PCR产物鉴定
700 bp 600 bp
乙肝基因PCR产物鉴定
阳性 - + + -
对照
400 bp 300 bp
（2）个体疾病的预防：易感基因 （3）个体化用药的指导：药物代谢酶等 （4）个体身份的验证：识别个体、亲子
鉴定等
Apo B
• 载脂蛋白B基因位于2号染色体断臂末端，全长 43Kb；
• DNA 3’端181bp构成一种由11-16bp重复排列的超 变异小卫星序列，分布在500-800bp之间；
• ApoB是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）的主要 结构蛋白 ,血液中ApoB的测定值可直接反映LDL的 含量 .
实验三：琼脂糖凝胶电泳及基因多态性
实验内容
• 1、乙肝病毒基因PCR、apoB基因PCR（已完 成）；
• 2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；
• 3、鉴定乙肝病毒基因PCR产物的DNA凝胶电 泳：1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，30min；
一、DNA琼脂糖凝胶电泳
• 导致血浆胆固醇升高的基因突变 ：
– ApoB基因遗传变异可合成有缺损的ApoB蛋白质， 后者与LDL受体亲和力下降，引起LDL清除障碍， LDL在血浆中蓄积。
– apoB DNA多态性或遗传变异与高胆固醇血症、 动脉粥样硬化、心肌梗赛、冠心病以及肥胖之 间密切相关；
• 导致血浆胆固醇水平降低的基因突变 :
单条带，700bp左右）
，315bp）
1. 电泳前准备
准备内容
• 本实验的预期目标：通过观察电泳条带的 差异，检测来自不同样本的apoB基因的多 态性.
apoB基因PCR产物鉴定
700 bp 600 bp
乙肝基因PCR产物鉴定
阳性 - + + -
对照
400 bp 300 bp
（2）个体疾病的预防：易感基因 （3）个体化用药的指导：药物代谢酶等 （4）个体身份的验证：识别个体、亲子
鉴定等
Apo B
• 载脂蛋白B基因位于2号染色体断臂末端，全长 43Kb；
• DNA 3’端181bp构成一种由11-16bp重复排列的超 变异小卫星序列，分布在500-800bp之间；
• ApoB是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）的主要 结构蛋白 ,血液中ApoB的测定值可直接反映LDL的 含量 .
实验三：琼脂糖凝胶电泳及基因多态性
实验内容
• 1、乙肝病毒基因PCR、apoB基因PCR（已完 成）；
• 2、鉴定apoB基因PCR产物的DNA凝胶电泳： 1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，1h；
• 3、鉴定乙肝病毒基因PCR产物的DNA凝胶电 泳：1.5%琼脂糖凝胶浓度，100V，30min；
一、DNA琼脂糖凝胶电泳
• 导致血浆胆固醇升高的基因突变 ：
– ApoB基因遗传变异可合成有缺损的ApoB蛋白质， 后者与LDL受体亲和力下降，引起LDL清除障碍， LDL在血浆中蓄积。
– apoB DNA多态性或遗传变异与高胆固醇血症、 动脉粥样硬化、心肌梗赛、冠心病以及肥胖之 间密切相关；
• 导致血浆胆固醇水平降低的基因突变 :
单条带，700bp左右）
，315bp）
1. 电泳前准备
准备内容
分子标记辅助选择育种特点和方法
形态学标记（morphological marker） 细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular marker)：DNA分子遗传
标记，或DNA标记。
第18章 分子标记辅助育种
1. 形态标记(morphological markers)： • 是指植物的外部形态特征，如矮秆、白化、黄化、
第18章分子标记辅助育种?对基因组dna进行双酶切在使用的两种限制性酶中进一步将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后pcr反应的引物结合位点通过选择在末端上分别添加1133个选择性碱基的不同引物选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合从而实现特异性扩增第18章分子标记辅助育种第18章分子标记辅助育种第18章分子标记辅助育种五snp标记?snp即单核苷酸多态性标记主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的dna序列多态性包括单碱基的转换颠换以及单碱基的插入缺失等
第18章 分子标记辅助育种
第18章 分子标记辅助育种
五、分子标记的原理和遗传特性
(二)RFLP标记 1.RFLP标记的原理
植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
第18章 分子标记辅助育种
(三)、SSR标记
变态叶、雄性不育等。广义上还包括色素、生理特 征、生殖特性、抗虫抗病性等。 • 形态标记的获得
一般通过自然突变或物化诱变来获得具有特定形 态特征的遗传标记材料，然后通过两点或三点连锁 测定法确定标记基因与目标性状之间的关系。
通过不同标记基因材料之间的相互杂交，可以选 择出具有多个标记基因的材料。
标记，或DNA标记。
第18章 分子标记辅助育种
1. 形态标记(morphological markers)： • 是指植物的外部形态特征，如矮秆、白化、黄化、
第18章分子标记辅助育种?对基因组dna进行双酶切在使用的两种限制性酶中进一步将酶切片段和含有与其粘性末端相同的人工接头连接连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后pcr反应的引物结合位点通过选择在末端上分别添加1133个选择性碱基的不同引物选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合从而实现特异性扩增第18章分子标记辅助育种第18章分子标记辅助育种第18章分子标记辅助育种五snp标记?snp即单核苷酸多态性标记主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的dna序列多态性包括单碱基的转换颠换以及单碱基的插入缺失等
第18章 分子标记辅助育种
第18章 分子标记辅助育种
五、分子标记的原理和遗传特性
(二)RFLP标记 1.RFLP标记的原理
植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
第18章 分子标记辅助育种
(三)、SSR标记
变态叶、雄性不育等。广义上还包括色素、生理特 征、生殖特性、抗虫抗病性等。 • 形态标记的获得
一般通过自然突变或物化诱变来获得具有特定形 态特征的遗传标记材料，然后通过两点或三点连锁 测定法确定标记基因与目标性状之间的关系。
通过不同标记基因材料之间的相互杂交，可以选 择出具有多个标记基因的材料。
ISSR标记技术及其在遗传多样性研究中的应用
ISSR 标记技术及其在遗传多样性研究中的应用谢佳燕 张知彬3(中国科学院动物研究所农业虫鼠害综合治理国家重点实验室,北京,100080)摘要:ISSR (Inter 2S imple Sequence Repeat )技术是在PCR 中直接使用微卫星序列进行DNA 扩增的一种DNA 分子标记。
文章主要介绍了ISSR 标记的原理、方法、特点及其在遗传多样性研究中的应用。
ISSR 标记方法具有无需知道任何靶标序列的微卫星背景信息、遗传多态性高、检测快速等特点,在遗传多样性研究中具有广泛的应用前景。
关键词:ISSR 技术;应用;遗传多样性中图分类号:Q751 文献标识码:A 文章编号:1000-1050(2004)01-0077-07I nter 2Simple Sequence R epeat and Applicationin the R esearch of G enetic DiversityXIE Jiayan ZH ANG Zhibin(State K ey Laboratory o f Integrated Management o f Pest Insect and Rodentsin Agriculture ,Institute o f Zoology ,the Chinese Academy o f Sciences ,Beijing ,100080)Abstract :The purpose of this review is to introduce principles ,methods ,characteristics and applications of a new DNA marker ,inter 2simple sequence repeat (ISSR ),which inv olves the use of microsatellite sequences directly in the polymerase chain reaction (PCR )for DNA amplification 1ISSR using SSR -based primers is a very useful system for efficient retrieval and analysis of genetic in formation in eukary otes 1The ISSR technique tests fast ,requires very little genomic sequence data and screens s o many polym or 2phisms in an assay 1The advantages of ISSR should make this marker system used widely in the research of genetic diversity 1K ey w ords :ISSR ;Application ;G enetic Diversity 近年来,随着分子生物学的迅速发展,DNA 分子标记技术广泛地应用于群体遗传多样性和保护生物学的研究,如限制性片段长度多态(RF LP )、随机扩增多态性(RAPD )、微卫星(Microsatellite )和扩增限制性片段长度多态分析(AF LP )等[1～8]。
3-分子标记技术原理、方法及应用
细胞学标记
植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染 色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等） 和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色 体区域定位
缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长 时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细 胞学方法进行检测
生化标记
主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从 组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法 将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影 响较小
缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相 当有限; (2)有些酶的染色方法和电泳技术有一 定难度
分子标记
主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种 差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA 间的差异，也叫DNA标记。
2/片段迁移率的变化要反映分子量的差异 ————DNA在聚丙烯酰胺凝胶上迁移率也受构象 变化影响
RFLP 基 本 步 骤
RFLP patterns in Pinus densata
RFLP
优点: 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响
共显性，非常稳定 起源于基因组DNA自身变异，数量上几乎不受限制
分子标记技术原理、方法 及应用
黄健子 2011.10
一、遗传标记的类型及发展 二、几种常见分子标记的原理及方法 三、分子标记技术的应用
一、遗传标记的类型及发展
遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染
色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一 种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和 可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变 型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标 记、生化标记和分子标记四种类型。
DNA指纹技术的原理与应用
DNA指纹技术的原理与应用生物技术1001班，谢晓梅，0306100209摘要：随着分子生物学和遗传性的迅速发展，遗传多态性的研究已经从形态水平深入到分子水平。
DNA指纹技术是分子生物学中一种新技术，它是从分子水平区别不同种类生物之间以及同种生物之间差异的重要手段，为DNA多态性的研究提供了便利的技术手段，同时在法医学、医学、遗传育种、物种进化等方面得到广泛应用。
本文综述了DNA多态性研究与DNA指纹技术的基本原理、具体分析技术、应用以及前景等。
关键词：DNA多态性；DNA指纹图谱；原理；技术；应用1.DNA指纹技术的原理1.1.DNA的多态性多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或者多种不连续的变异型或基因型或等位基因，也称之为遗传多态性。
每一个个体在遗传上的不同不仅表现在基因产物上，其本质是DNA水平上的差异。
一般是由于DNA分子中不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域发生了中立突变，这些突变构成的DNA变异，在群体中如果大于10%，则称为DNA分子水平的遗传多态性，简称DNA多态性。
1.1.1DNA多态性的发现1980年，Wyman和White在人DNA文库中的随机片段中分离到一个可揭示DNA多态性的高变重复序列。
随后，1985年，Jeffrey 等用人肌红蛋白基因内含子中33bp的核心序列的高变重复序列片段做探针，获得了好像人的指纹一样具有高度特异的DNA“指纹图”，并首次用于亲子鉴定中，为DNA多态性应用与法医学等领域开辟了新纪元，也促进了DNA多态性的更广泛更深入的研究。
1.1.2 DNA多态性的分类DNA多态性包括DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性和单核苷酸多态性。
1.1.2.1DNA片段长度多态性（FLP）DNA片段长度多态性，即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA酶切片段长度的变化，又称为限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。
华南农业大学农学院《生物技术》复习题(附答案)
华南农业大学农学院《生物技术》复习题（附答案）一、有关名词遗传标记指可稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。
遗传多态性现代遗传学中是指基因组中任何座位上的相对差异或DNA序列的差异。
形态标记简单性状的遗传（普通遗传学）细胞学标记染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）生化标记同工酶与电泳技术（生化遗传学）同工酶是指具有功能相同而结构及组成有差异的一类酶分子标记DNA标记，以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。
PCR 聚合酶链式反应。
是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。
RFLP 限制性片段长度多态性。
不同样品DNA经限制性酶酶解所产生片段大小的差异。
RAPD 随机扩增多态DNA。
是以一个寡聚脱氧核苷酸单链作随机引物(primer) ，通过PCR扩增基因组DNA，获得长度不同的多态性DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增片段的多态性。
SSR 简单序列重复。
是一类由几个核苷酸组成的基序（motif）为重复单元串联组成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置。
AFLP 扩增片段长度多态性。
是一种通过限制性内切酶酶切DNA产生不同长度DNA片段，再结合PCR 技术来检测DNA多态性的分子标记技术。
FM遗传图谱又称遗传连锁图谱。
指反映基因组内基因(遗传标记)在染色体上线性排列顺序及其相对位置的图谱。
分子遗传图谱不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况。
作图群体是指用于遗传作图的符合孟德尔定律的分离群体。
RIL群体即重组近交系群体，是由重组近交系组成的分离群体，由F2经多代自交一粒传使后代基因组相对纯合的群体。
DH群体是由通过对F1进行花药离体培养或通过特殊技术获得单倍体植株再经染色体加倍而获得的加倍单倍体群体。
主效基因又称主基因，是一类控制质量性状的基因，其性状表现为不连续的变异。
微效基因是一类控制数量性状的基因，因此通常称为数量性状座位QTL，其性状表现为连续的变异。
PCR的原理与应用课件
加上EcoRI接头，磷酸化，cDNA分级
cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
.
*
cDNA序列的克隆
.
*
（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
.
*
EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
.
*
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
.
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cDNA合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA合成过程示意图
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cDNA序列的克隆
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（二）PCR的种类 2.Nested PCR: 巢式PCR 原理: 利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 优点: 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。 应用: 一般应用于动物方面。如: 病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。
•高灵敏度
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
•适用于大量样品分析
一步法和两步法RT-PCR的比较
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EcoRI
寡聚(dT)随机6碱基引物R
寡聚(dT)
随机6碱基引物R
mRNA
(A)n (T)
(A)n
(A)n (T)
R
R
R
R
R
R
第二链合成
(A)n (T)
(A)n
R
R
R
R
R
R
(A)n (T)
EcoRI
很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖, Mullis是其中之一
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Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链, 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶, 面对面地合成着DNA, ……
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《分子标记辅助育种》PPT课件
为了显示染色体的结构改变， 从60年代起建立了一系列染色 体显带技术，包括Q、G、C、R、 T带分析等。其中应用最广的 是G显带技术。为了进一步提 高分辨率，后来又建立了高分 辨G显带技术，可把染色体的 细微变化精确地定位到某一特 定染色体的某一区带上。
Cytogenetic Mapping（2）
70受体亲本受体亲本供体亲本供体亲本不含优质基因不含优质基因含优质基因含优质基因ff11受体亲本受体亲本bcbc11目标基因定位目标基因定位标记辅助选择标记辅助选择中选中选bcbc11受体亲本受体亲本含优质基因含优质基因bcbc22bcbc33标记辅助选择标记辅助选择标记辅助选择标记辅助选择中选中选bcbc33含优质基因含优质基因新育成的优质品种新育成的优质品种受体亲本遗传本背景受体亲本遗传本背景优质基因优质基因交交目标基因的定位目标基因的定位与标记辅助回交与标记辅助回交育种相结合程序图育种相结合程序图中选中选bcbc11受体亲本受体亲本含优质基因含优质基因71二大范围群体内的单目标基因slsmas分析方法基本原理在一个随机杂交的混合群体中首先在一个很大群体中利用分子标记辅助选择目标性状尽可能使选择群体足够大使中选的植株就目标位点纯合而在目标位点以外的其它基因位点上保持有大的遗传多样性最好仍呈孟德尔分离这样分子标记筛选后仍有很大遗传多样性供育种家通过传统育种方法选择产生新的品种和杂交种
RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键 而艰巨的工作。只要实验条件标准化，可以提高RAPD 标记的再现性。
二、分子标记的原理和遗传特性
(三)AFLP（扩增片断长度多态性）标记
AFLP即扩增片段长度多态性，是1993年由 Marc 和Pieter 发明创造的一种DNA分子标记。
该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增， 又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强， 一次可检测到100~150个扩增产物，因而非常适合 绘制品种指纹图谱及进行分类研究。
Cytogenetic Mapping（2）
70受体亲本受体亲本供体亲本供体亲本不含优质基因不含优质基因含优质基因含优质基因ff11受体亲本受体亲本bcbc11目标基因定位目标基因定位标记辅助选择标记辅助选择中选中选bcbc11受体亲本受体亲本含优质基因含优质基因bcbc22bcbc33标记辅助选择标记辅助选择标记辅助选择标记辅助选择中选中选bcbc33含优质基因含优质基因新育成的优质品种新育成的优质品种受体亲本遗传本背景受体亲本遗传本背景优质基因优质基因交交目标基因的定位目标基因的定位与标记辅助回交与标记辅助回交育种相结合程序图育种相结合程序图中选中选bcbc11受体亲本受体亲本含优质基因含优质基因71二大范围群体内的单目标基因slsmas分析方法基本原理在一个随机杂交的混合群体中首先在一个很大群体中利用分子标记辅助选择目标性状尽可能使选择群体足够大使中选的植株就目标位点纯合而在目标位点以外的其它基因位点上保持有大的遗传多样性最好仍呈孟德尔分离这样分子标记筛选后仍有很大遗传多样性供育种家通过传统育种方法选择产生新的品种和杂交种
RAPD标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键 而艰巨的工作。只要实验条件标准化，可以提高RAPD 标记的再现性。
二、分子标记的原理和遗传特性
(三)AFLP（扩增片断长度多态性）标记
AFLP即扩增片段长度多态性，是1993年由 Marc 和Pieter 发明创造的一种DNA分子标记。
该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增， 又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强， 一次可检测到100~150个扩增产物，因而非常适合 绘制品种指纹图谱及进行分类研究。
DNA指纹图谱在农作物品种鉴定中的应用
DNA(脱氧核糖核酸)是细胞染色体中的遗传基因,其分子各个片段就代表各个遗传信息。
由于DNA指纹图谱直接反映DNA水平上的差异,它成为当今最先进的遗传标记系统。
DNA指纹图谱技术主要有:限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polym or2 phism,简称RF LP)、随机扩增多态性(Random am plified polym orphic DNA,简称RAPD)、小卫星DNA (Mini2satellite DNA)、微卫星DNA (Microsatellite DNA)、内部简单重复序列(ISSR)、扩增片段长度多态性(Am plified fragment length polym or2 phism,简称AF LP)等等。
一、DNA指纹图谱的方法11RF LP方法RF LP方法是G rodzicker等人于1974年发明的。
它是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。
RF LP方法于上个世纪80年代开始应用于植物,在水稻、小麦、玉米、蕃茄和马铃薯等作物上的研究都已有报道。
但RF LP的多态信息含量是相对而言的,在一些作物上RF LP探针可进行品种间及种间的鉴别,而在小麦、马铃薯、大豆等作物上的多态性较低。
特别是小麦,它是严格的自花授粉作物,基因组较大,多态性很低(即使在相当分散的品种间也是如此)。
因而,RF LP方法在指纹图谱中的应用受到限制。
21RAPD方法RAPD方法是Willams等人于1990年发明的。
它是利用扩增DNA片段长度差异来检测生物个体的分子标记技术。
它可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下,对其进行基因组指纹图谱的构建。
其相对于RF LP方法较简便,DNA用量也较少,且省去了使用放射性同位素,受到了许多学者的重视。
Welth1991年曾用RAPD分析玉米杂交种的品种纯度,He等人1992年曾用RAPD识别小麦品种,在花生、小麦、水稻等作物上也曾进行过深入研究。
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第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用 DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams等 1990；Welsh等 1990）。尽管RAPD技术诞生的时间不长，但由于其独到的DNA多态性以及快速、 简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段之一。本文将对RAPD技术的基本原理和特点、基本操作程序以及RAPD技术在检测物种遗传多样性中的应用作一简单的介绍。 11.1 RAPD技术的原理和特点
RAPD技术建立在PCR技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增 DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组DNA序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的3端相距在一定长度范围之内，就可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生DNA片段的插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR产物的检测即可探知基因组 DNA在这些区域内的多态性。 进行RAPD分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组DNA多态 性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD可以 对整个基因组进行多态性检测。 RAPD技术与其他DNA多态性检测技术如 RFLP（restriction fragment length polymorphism）、DNA指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD技术可以在对受试物种（包括动物、植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作简便，一次RAPD扩增实际上就是一次简单的PCR反应，适合大量样本的快速分析；③所需模板DNA量极少，一般一次扩增只需5～50ng的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA进行直接扩增。这对于珍稀濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的（王文等 1994；陈永久等 1997，1998；Gwakisa等 1994；Yi 1995；
本章作者：陈永久，魏 伟，史宪伟，张亚平 第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用 131 Tibayrenc等 1993；Wachira 1995）。 11.2 RAPD的基本操作方法
RAPD的操作方法大体上包括DNA提取、扩增、电泳和染色等几个主要步骤。具体的操作过程见 Williams等（1990，1993）和 Welsh等（1990）的论述。随着 RAPD技术的发展，该技术也作了一些改动（Bucci，Menozzi 1993；Dawson等1993；Lawson等1994）。
11.2.1 RAPD模板的制备 11.2.l.1 动物组织总 DNA的提取 取新鲜动物组织材料，如肝脏、肾脏或肌肉等10～100mg，剪碎后加入750µl的STE （0.1mol／dm3 NaCl，20mmol／dm3EDTA，10mmol／dm3 Tris-HCl，pH值 8.0）、80µl 10％SDS
和8µl 20mg／ml的蛋白酶K。在56℃下消化12～24／小时后，用酚、氯仿、异戊醇（25:24: 1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次。每次抽提时间为12～24小时。上清液用等体积 的异丙醇沉淀及70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE溶解，置于4℃冰箱中备用。
11.2.1.2 植物及其真菌的总DNA提取 取50～500mg植物或真菌的新鲜材料，分别经95％的乙醇、70％的乙醇和超净水清洗。 将材料剪碎后，在材料中加入700µl十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液（2％CTAB， 1.4mol／dm3NaCl，0.2％ 2-巯基乙醇，20mmol／dm3EDTA，100mmol／dm3Tris-HCl，pH值
8.0）。在56℃下消化12～24小时。用酚、酚－氯仿－异戊醇（25:24:1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次，每次抽提时间为12～24小时。将上清液用等体积的异丙醇沉淀后，用70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE溶解，然后置于 4℃冰箱中备用。
12.2.2 RAPD反应体系 11.2.2.1 RAPD反应的仪器和试剂 用于 RAPD扩增的实验仪器主要是一台 PCR扩增仪。由于 RAPD反应中的引物和模板 之间的结合是随机的，因此我们建议使用一台固定的PCR扩增仪进行RAPD反应。 RAPD反应的试剂有：①PCR缓冲液，各家公司生产的TaqDNA酶均配有相应的缓冲液；② dNTP，包括 dATP，dGTP，dCTP和dTTP 4种，每种浓度为25mmol／dm3 ；③
MgCl2 25mmol／dm3；④随机引物，美国Opren公司生产800种随机引物，其他一些公司也有生产；⑤牛血清白蛋白（BSA）10mg／ml，或明胶 0.01％；③TaqDNA聚合酶。
11.2.2.2 RAPD的PCR体系 PCR体系可以是10µl、20µl、25µl、50µl或100µl。反应体系中各成分的浓度为：①随机引物，通常为10对碱基组成，其中G＋C％为50％～70％，用于RAPD的引物浓度为0.2µmol／dm3；②dNTP（包括dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；用于RAPD反应的每种dNTP 132 遗传多样性研究的原理与方法 浓度为0.1mmol／dm3；③PCR反应缓冲液：包括10mmol／dm3Tris-HCl，pH值9.0，50mmol／ dm3 KCl，2.5mmol／dm3 MgCl2 ；④0.001％明胶（或 2mg／ml的 BSA）；⑤基因组 DNA:5～ 50ng的基因组 DNA；③TaqDNA聚合酶：0.5～1µl的 TaqDNA聚合酶；⑦矿物油：反应混 合物用适量的石蜡油覆盖，以防治反应液蒸发。
11.2.2.3 RAPD反应程序 RAPD为一种特殊的PCR技术，与常规PCR不同的是，RAPD要求的退火温度较低，这是由 于RAPD使用的引物较短所致（10bp）。通常的RAPD扩增条件是：①94℃预变性200秒；②94℃变性1分钟，36℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，包括40个循环；③72℃最后延伸300秒。 但有时PCR扩增仪的性能并不完全一致，因此RAPD反应的条件也应作相应的改变。用于 RAPD反应的 DNA必须是片段大、纯度高的基因组 DNA（Genomic DNA）。如果DNA样品混有 杂质蛋白质或PCR反应抑制剂，那么就会大大影响RAPD扩增效果（陈永久，张亚平 1997）。
11.2.2.4 RAPD产物的检测 RAPD产物可用1／4体积的溴酚蓝－EDTA－甘油混合液，采用1．5％的琼脂糖胶检测， 电泳的电压小于5V／cm。最后用溴化乙锭染色，在紫外光下拍照成像。
11.3 RAPD数据的统计方法 经过DNA提取、扩增及电泳、染色过程得到了多态程度较高的RAPD谱带。目前对RAPD 数据处理还没有建立起一套诸如同工酶数据处理的较完整的统计体系。近年来一些学者在 进行RAPD研究时，提出了各种不同的资料处理方法，但很多公式都是借用同工酶或RFLP的 统计方法。国际上流行着一些RAPD数据处理的方法和程序，比较常用的是UPG-MA（无权重 配对算术平均数法），其基本原理是运用Jaccard相似系数（Anderberg 1973；Vierling， Nguyen 1992；Heun等 1994；Lawson等 1994）。与其类似的是NTSYS（数量分类系统），还有使用SAS统计分析软件包中CLUSTER程序等方法（Keil，Griffin 1994；Baruffi等1995）。 在检测不同个体和群体之间的遗传变异时，RAPD标记可看作是有用的孟德尔特征（Buc-ci，Menozzi 1993）。RAPD标记具有显／隐性，所以对于自交的种类，RAPD谱中某多态位点一般是纯合的，扩增产物的频率可以作为等位基因的频率；对于异交的种类，RAPD谱中某一多态位点可能是杂合的，扩增产物存在的频率只能作为RAPD表型频率来定义（Williams 等 1990；Caetano-Anollés 1994）。对于已知的等位基因频率，可用Nei指数来计算群体的基因多样性、遗传分化系数及遗传距离，也可用Shannon指数来估算群体的遗传多样性（Nei 1973，1975；Lewontin 1972）。但对于RAPD表型频率，则只能估算 Shannon表型多样性指数和Jaccard相似系数（距离）（Chalmers等 1992；Keil，Griffin 1994）。 采用琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色得到的带相对较少，比较易于分析。而用聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色得到的带比较多，这是因为银染比较敏感（Williams等1993；Bas-