肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型(一)
【关键词】肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型
摘要：目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA，建立和优化随机扩增多态性DNA(RAPD)反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增，筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用，每一菌株均可扩增出4～10条DNA片段，大多数片段在100～2000bp之间，共扩增出42条RAPD条带，其中共有条带7条，多态性条带35条，多态性为833%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在426%～100%之间，在0850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势，对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。
关键词：肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型ApplicationofRAPDinmoleculartypingSalmonellaenteritidisisolates
Abstract：ObjectiveMoleculartyping12strainsoftheSalmonellaenteritidisisolatedfromdifferentorigins.Metho dsThegenomicDNAofdifferentSalmonellaenteritisstrainswereextractedandrandomamplifiedpolym orphicDNA(RAPD)systemwasdevelopedandoptimized.22randomprimersweretestedtotheanalysiso n12strainsofSalmonellaenteritisisolatedfromdifferentsources,andtheclearandconstantfingerprints wereselectedforstatisticalanalysis.Results4effectiveprimersnamedOPG-03,OPG-06,OPG-07andOP G-13wereselected,withwhicheachstraincouldbeamplified4to10DNAfragmentsof100bp～2000bp.42RAPDbandswereamplified,833%ofthembeingpolymorphic.Thecomparativeresearchoft heclusteranalysisbasedontheRAPDbandsspectrashowedthatthesimilaritycoefficientbetweentwodi fferentstrainsvariedfrom426%to100%,and12Salmonellaenteritisstrainsinthisexperimentcouldbecl assifiedto5groupsaccordingtotheirgeneticrelationship.ConclusionUsingRAPDtosubtypeandcharact erSalmonellaenteritisatmolecularlevelismorerapidandsensitivethanothertypingmethods,whichind icatebroadfutureofapplication.
Keywords：Salmonellaenteritis;RAPD;type
菌株分型对肠炎沙门菌的流行病学调查，以及研究其感染和传播机制具有重要意义。随机扩增多态DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD）具有操作简便、快速、敏感及不需先了解目的基因的核酸序列等优点，目前广泛应用于微生物的分子分型和鉴定、物种亲缘关系的确定及分子流行病学等领域的研究〔1-3〕。本研究应用RAPD技术对12株不同来源的肠炎沙门菌进行分子分型，分析指纹图谱对其鉴别的价值并确定不同菌株间亲缘关系，为肠炎沙门菌食源性疾病预防控制和鉴别诊断提供新方法。结果报告如下。
1材料与方法
11材料(1)菌株与来源:12株肠炎沙门菌分别来自病人分离株4株（菌株号为SEWX01～04），生猪肉分离株2株（菌株号为SEWX05，06），熟食样品分离株1株（菌株号为SEYZ08），鸡分离株3株（菌株号为SEYZ11～13），生鸡肉分离株2株（菌株号为SENT19，20）。(2)酶与试剂:TaqDNA聚合酶,DNAMarker，dNTPs(大连宝生物工程有限公司)；溶菌酶,蛋白酶K，RNA 酶,Sarkosyl(上海申能博彩生物工程公司)；其他试剂均为国产分析纯。(3)随机引物:22条随机引物（编号为OPG-01～OPG-22）由上海申能博彩生物工程公司合成,均为10bp，经筛选用于分型的共有4条，分别为:OPG-03：5＇-AATCGGGCTG-3＇；OPG-06：5＇-CGGCCCCTGC-3＇；OPG-07：5＇-GGATCCTGAC-3＇；OPG-13：5＇-CAGCTCCTGT-3＇。
12方法
121基因组DNA提取挑取单菌落接种100ml乳糖发酵(LB)培养基，37℃震荡培养18h，4℃冷
却；6000r/min离心15min，去上清，用预冷三羟甲基氨甲烷(TE)缓冲液洗涤和重悬菌体至
3ml；加04ml溶菌酶（10g/L），37℃温浴10min；加04ml30%Sarkosyl溶液在70℃和37℃分别作用20和60min；加蛋白酶K，56℃作用2h；经苯酚多次抽提后加RNA酶37℃作用6h；苯酚抽提直至水相澄清；用无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤1次，自然干燥后溶解于1mlTE缓冲液。取10μlDNA样品用1%的琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性；取50μlDNA稀释到500μl，测定吸光度A260nm和A280nm检验纯度并计算DNA浓度。
122PCR扩增在总体积为25μl的反应体系中包含基因组DNA50ng作为模板，25μl10×PCR反应缓冲液，25mmol/LMg2+，Taq酶15U，200μmol/LdNTPs，25pmol随机引物，双蒸水空白做阴性对照；循环参数为：93℃2min，36℃1min，72℃2min1次循环；93℃1min，36℃1min，72℃2min，40次循环；93℃1min，36℃1min，72℃10min1次循环。扩增结束后取10μl产物在14％的琼脂糖凝胶上电泳(电压5V/cm)15h，经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上观察并拍照记录。
123RAPD多态性谱带确定与分析对12株肠炎沙门菌分离株进行RAPD扩增，每次实验重复2次,筛选多态性和重复性较好的扩增条带做统计分析。将12个菌株对应的同一电泳迁移位置上扩增条带按"1"和"0"进行统计，建立数据矩阵。按Nei等〔4〕公式F=2Nxy/(Nx+Ny)计算不同菌株间的遗传相似系数，其中F是菌株x和y的遗传相似系数,Nxy是菌株x和y共同具有的条带数,Nx是菌株x扩增的条带数,Ny是菌株y扩增的条带数。根据遗传相似系数利用类平均法(UPGMA法)进行聚类分析。
2结果
21模板DNA提取（图1）纯度检测结果表明,提取的基因组DNA的A260nm/A280nm在18～20范围内，符合模板DNA的纯度要求。基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果表明,基因组DNA 条带均一，未见断裂和降解现象，DNA模板完整，可以用于RAPD分析。
M:DNAmarker(λDNA/HindⅢ);1:SEWX01;2:SEWX02;3:SEWX03;4:SEWX04;5:SEWX05;6:SEWX06;7: SEYZ08;8:SEYZ11;9:SEYZ12;10:SEYZ13;11:SENT19;12:SENT20
图1基因组DNA凝胶电泳结果（略）
22随机引物筛选(表1)利用22条随机引物分别对12株肠炎沙门菌基因组DNA进行RAPD扩增。结果显示，随机引物OPG-01、OPG-02、OPG-04、OPG-10、OPG-19没有扩增出任何条带；随机引物OPG-05、OPG-08、OPG-09、OPG-11、OPG-12、OPG-14～OPG-18、OPG-20～OPG-22能够扩增出条带，但扩增的指纹图谱中没有多态性条带；而随机引物OPG-03、OPG-06、OPG-07、OPG-13条引物可以扩增出较好的多态性条带。
