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细胞侵袭实验指导

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细胞侵袭
对于进行细胞侵袭的研究者来说，传统试验方法具有染色及计数会占用实验者大量的精力，且数据单一，实验通量及重复性低等特点。

本实验采用罗氏全新的方法来监测细胞侵袭，将CIM-Plate 16结合RTCA DP Analyzer 使用，这个独特的装置可在无标记条件下对细胞侵袭进行实时监控。

CIM-Plate 16由上室和下室组成，两者之间由微孔膜分隔开。

金制串珠状微电极紧密结合，附着于PET膜下层，并覆盖80%表面积。

趋化剂添加到下室，上室内添加研究的细胞和选择性添加细胞外基质胶。

当细胞设法穿过膜，进入下室，黏附到电极上，系统可测量电阻抗变化。

随着微孔膜下侧细胞数目的增多，电阻抗增大，表现为细胞指数的变化，并被RTCA DP Analyzer记录下来。

接下来，我们介绍整个细胞侵袭实验的流程
一、编辑实验程序
打开RTCA software，可看到三个用户权限ID，本次实验我们用administrator登录，密码为小写的administrator。

user one 和user two登录时无需密码。

点击确认后，可根据实验需求进行选择适当的cradle。

启动RTCA DP软件后，如果软件仍停留在上一个实验界面，可以在file中点击release，开启一个新的实验。

experiment note页面下，填写本次实验的相关信息，包括实验名称，所使用细胞板的ID number信息等，备注栏内填写一些简单的实验设计。

到Layout页面下，输入本次实验的设置，选中A1-H1，填写细胞系名称，细胞类型是HT-1080，每孔20000个细胞，点击apply，设置信息完成。

选择A1-F1，本实验将从高到低浓度Matrigel进行包被，最高浓度为10%，以2倍稀释度稀释，两个重复。

选择G1和H1，填写serum Free Medium作为空白对照,保存后，将A1-H1信息复制到第二排。

此时可见16孔板设置完成的实验信息。

转到schedule页面，点击增加一步按钮。

第一步是用于检测背景值的实验步骤，step-status 显示为IDLE，表示未完成，请勿更改背景检测步骤参数。

点击增加步骤按钮，建立第二个实验步骤，这里根据检测时间的长短，可以自行设计实验的检测次数及间隔时间。

二、准备实验以及包被
从冰箱中取出Assembling tool 以及CIM plate 上板。

拆开上板，可见板上和盖子上均有蓝点标记，将蓝点对蓝点，把板放在Assembling tool上。

由于CIM plate 板的电极是铺在孔膜的背部，所以上板不能直接接触桌面，安装时需特别注意。

首先进行Matrigel包被，每孔内加入50 µl matrigel ，每做完一个梯度，即4个孔后，马上从孔内轻轻吸出30µl Matrigel。

如果出现气泡，用枪头小心剔除。

空白对照的四个孔同样加入50µl 的无血清培养基，然后吸出30µl。

盖上盖子，将整个Assambling tool 连同板子，放入培养箱中孵育4-5 小时，使Matrigel 凝结。

三、组装RTCA CIM Plate-16 以及测量CI背景值
取出CIM plate 下板，蓝点对蓝点方向，放在Assambling tool第二个槽内，下板中加入160µl预温好的完全培养基，动作缓慢且在最后轻抬枪头，可见整个液面形成漂亮的弧形。

将CIM-Plate 16 Assembly Tool旋转90度，小心不要干扰液面
将上板拿起，水平移到下板上方，快速用力扣下，中间不能有停顿，听到卡卡两声，表明上板和下板安装完成。

检查安装是否紧扣在一起。

在上板中每孔加入30 µl 无血清培养基，盖上上板盖子
将整块CIM-Plate 16 放入RTCA DP 分析仪。

放在培养箱中平衡一个小时。

一小时后，进入schedule 页面，选中第一步，点击开始按钮。

背景值测完后，显示ready for starting next step.回到Message页面，看是否有任何报错信息。

四、准备细胞，并加入RTCA CIM Plate-16 上腔
取出CIM plate，重新放回到超净台中的Assambling tool 上，每孔加入100微升含20000个细胞的细胞悬液。

细胞准备参照本光盘的细胞传代及其他视频的相关操作，重悬HT-1080细胞。

为了避免培养箱内由于温差产生蒸腾作用而引起边缘效应，将CIM培养板，在常温下静置半个小时。

五、运行实验
将CIM plate 重新放回RTCA DP 分析仪上，看到提示plate scanned, connection is OK后，
点击开始第二步。

这时机器开始每15分钟检测一次孔内细胞的迁移的情况。

六、实验结果分析
在Cell Plot 页面，选择显示平均值以及标准差，点击add ,可见不同组得到的实验信号。

如图所示，当Matrigel浓度最大时，细胞侵袭越困难，而无血清培养基对照孔内，细胞侵袭的信号就非常明显。

根据包被Matrigel的浓度由高到低，细胞侵袭能力逐渐增强。

七、注意事项
1、CIM-Plate 16不能重复使用：
CIM-Plate板上可能会有细胞或包被试剂的残留，影响再次实验的结果可靠性及重复性。

2、健康的细胞培养物：
健康的细胞侵袭效率较高，此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。

实验细胞必须在前一天进行细胞传代，并保证消化时细胞融合达60%-80%
3、Matrigel使用要求：
由于Matrigel非常容易在常温下凝结成胶状而无法使用，要将Matrigel置于冰上。

侵袭实验前一天，需要将所需的Matrigel从-80度取出，放在4度保存，使其溶解成液状，另外，所有需要接触Matrigel的耗材，包括枪头，移液管，CIM plate 上板等需预先放在冰箱-20或者4度预冷。

4、无血清培养基制备细胞悬液：
制备细胞悬液前可先让细胞去血清饥饿12－24h，进一步去除上板中血清的影响，若上层中含血清，下层培养液的趋化作用就会减弱甚至消失了，影响实验的进行。

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Transwell侵袭实验

Transwell侵袭实验

Transwell侵袭实验1.实验前一天将ECM胶（8-12 mg/ml）（Sigma）放于4℃冰箱中融化过夜2.实验时将所用的枪头在冰上预冷半个小时，ECM胶用预冷的无血清1640按1：9稀释（稀释至1mg/ml），每孔中加入稀释好的ECM胶40μl，放入37℃培养箱中，孵育5h3.水化基底膜：吸出小室中残余液体，每孔加入70ul含无血清1640培养液，37℃，30min，吸去培养基4.对数生长期的细胞，胰酶消化细胞，0.1%血清1640悬浮，计数，稀释至密度为1 106/ml，每空中加200μl细胞悬液5.24孔板下室一般加入600µl含30%新生牛血清的1640培养基6.24h后，弃去孔中培液，PBS洗2遍，甲醇固定20分钟，0.1%结晶紫染色15-20 min，用清水洗3遍以上，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞7.400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数个人觉得做Transwell就像小马过河一样，要讲究个体化，不同的细胞侵袭能力不同，胶的稀释倍数、细胞上样量、上下室血清浓度差以及孵育时间也不同。

对于你的问题，我觉的不管是在温箱中放5个小时或者是在超静工作台中风干，其主要目的是为了让Matrigel从液体状变成胶冻状，在温箱中放置5个小时后，拿出来上室中肯定会有液体残留，此时一定要将残留的液体洗干净，然后在水化一下基底膜。

(1) 吸去培养液，用棉签轻轻擦除上室聚碳酸酯膜内侧面贴壁细胞，用0.01MPBS 漂洗两次，4%多聚甲醛固定10 分钟；(2) 吸去固定液，将膜风干，每孔加0.6ml 0.1%结晶紫染液，室温中放置20 分钟；(3) 轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将上室取出，从聚碳酸酯膜内侧面用吸水纸吸干水分，自然干燥；(4) 测定前，将各实验组上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6ml 33％醋酸脱色，充分振荡，每组设定5 复孔；同时设置调零孔（33％醋酸）；比色：每孔取脱色液150μl 加入96 孔板中，在570nm 处测定OD 值。

细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8µm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 µ、200 µL、1000 µL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。

如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。

实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。

2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。

3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。

4.把枪头剪去一小段（约3 µm）后在冰上吸取40 µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。

5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。

6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。

7.按照每孔200 µL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 µL，放入37 ℃孵箱培养。

8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。

9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。

10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。

11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。

transwell侵袭实验原理及步骤

transwell侵袭实验原理及步骤

transwell侵袭实验原理及步骤展开全文transwell侵袭实验就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，细胞会往高营养的培养液方向移动。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

transwell侵袭实验内容：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

常用0.4、3.0µm。

我们实验室用的是0.4µm。

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

（3）肿瘤细胞迁移实验常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

（4）肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子，细胞会分泌相关酶类消化模拟细胞外基质膜的基质胶，从而从上室迁移到下室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

细胞迁移和侵袭实验检测方法和原理

细胞迁移和侵袭实验检测方法和原理

细胞迁移和侵袭实验检测方法和原理细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。

细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。

细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。

胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。

细胞侵袭（cell invasion）是指细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域的能力。

细胞侵袭是正常细胞和癌细胞应对化学和机械刺激的反应。

在迁移到新区域之前，细胞外基质被细胞内的蛋白酶降解。

细胞侵袭常发生于伤口修复、血管形成和炎症反应以及组织的异常浸润、肿瘤细胞转移等过程中。

技术原理检测细胞迁移能力和侵袭能力常用的实验手段是Transwell实验。

Transwell顾名思义是“穿孔实验”，即将小室放入孔板中（常见的是24孔板），小室中含有密密麻麻的小孔，将细胞悬液加到小室中，小室放在加入完全培养基的24孔板内，细胞可通过形变穿过小室中的孔而跑到营养更丰富的小室外部并贴在外侧。

通过对小室外部的细胞进行染色计数，就可以判断细胞的迁移与侵袭能力的强弱。

Transwell的基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。

将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。

常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。