细胞侵袭实验(transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)实验介绍：细胞迁移和侵袭实验是通过将Transwell小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，研究细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜下的共培养、细胞趋化、细胞迁移和侵袭等多种方面的实验。

实验步骤：1.材料准备：可拍照显微镜、Transwell小室（孔径8μm，没包被胶的），24孔板、BD公司的Matrigel、无血清DMEM、(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基、DMEM完全培养基、1640完全培养基（也可加到20%血清）、无菌PBS、棉签、胰酶、4%多聚甲醛固定液或者甲醇、结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）。

2.实验步骤：2.1 基质胶铺板：用XXX的Matrigel稀释1：8，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2 制备细胞悬液：细胞撤血清饥饿12-24小时后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3 接种细胞：取细胞悬液100µl加入Transwell小室，24孔板下室加入600µl含20%FBS的培养基。

注意避免气泡的产生。

2.4 培养细胞：常规培养12-48小时。

24小时较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

2.5 结果统计：通过给细胞染色，在镜下计数细胞。

胞悬液；将细胞悬液加入上室中央，保持液面水平；将下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基；37℃培养箱中孵育20-24小时；取出transwell，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色；用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

注意事项包括确保transwell在24孔板中浸泡1小时，消化细胞时用无血清培养基洗涤2次并计数，将细胞悬液加入上室中央保持液面水平，下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基，37℃培养箱中孵育20-24小时，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色，用棉球擦去上表面细胞，并小心避免混淆实验组和对照组。

细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

Cell invasion protocols实验材料：1、24 transwell2、Matrigel 基质胶Becton-dickinson（BD）公司Matrigel 在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。

使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化过夜（避免反复冻融）。

注：使用时需接触Matrigel 的试管、移液吸头等均应预冷于-20℃；3、Diff-Quick染色溶液4、镊子5、棉签实验步骤1、matrigel在4℃自然融化（用多少，转移多少）过夜。

2、将实验使用的微量注射枪及枪头(蓝、黄枪头）在-20℃预冰。

3、500ul matigel + 500ul DMEM（不含牛血清且在4℃预储藏贮藏的）4、有枪头轻混匀。

5、分别在24-trans well 正中的8孔的上腔室中，加入该混合液70ul/孔。

6、在超净台（UV+ fan) 干燥3--4h7、待matrigel干燥后，抽去上层DMED，用500ulPBS轻清洗凝胶。

8、消化细胞，洗细胞（3次）重选细胞100ul（5×104）MCF-7细胞于上室中。

9、抚育待细胞贴壁生长后（由细胞生长情况而确定抚育时间）10、给药。

上室给药（无血清培养液），下室不给药（血清中含有5%-10%FBS），上室、下室培养液体积为500ul。

11、抚育24h。

12、染色：将小室从24孔板中取出，用Diff-Quick solution染色液染色。

13、用擦去transell 上层细胞，从底部将膜切下，粘在载玻片上并盖上盖玻片，于显微镜下取若干视野进行观察。

（此方法可长期保存，但transwell只能使用一次，还有其他染色方法可以借鉴，见其他参考文献，请参考）。

细胞侵袭转移实验报告细胞侵袭转移是癌症进展和转移的重要特征之一。

了解细胞的侵袭转移机制对于癌症预防和治疗具有重要意义。

本实验旨在研究细胞的侵袭转移能力，并探究其相关机制。

实验过程如下：1. 细胞培养与处理：选取一种具有侵袭能力的癌细胞株，如乳腺癌细胞MCF-7。

将细胞培养在含有适当营养和生长因子的培养基中，经过传代培养至适当细胞数目。

2. Transwell侵袭实验：将含有细胞的培养基加入到上游腔室中，下游腔室中加入含有化膜毛细孔的过滤膜，如Matrigel。

使细胞逐渐通过过滤膜向下游腔室侵袭。

培养一定时间后，取出过滤膜并使用染色剂染色，以观察和计数通过膜孔的细胞数量。

3. Western blot分析：用Western blot方法检测有关侵袭转移的分子标志物，如转录因子Snail和转录因子Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，转移至聚乙烯二醇膜上，用特异性抗体与目标蛋白结合。

通过免疫反应，使用化学发光显色剂检测目标蛋白的表达水平。

4. Real-time PCR分析：通过Real-time PCR技术检测相关基因的mRNA水平，包括Snail、Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取总RNA，逆转录为cDNA 后，用特异性引物进行PCR扩增。

通过观察PCR曲线和计算Ct值，比较各样本基因表达水平的差异。

实验结果如下：1. Transwell侵袭实验表明MCF-7细胞具有较强的侵袭能力。

染色显示通过过滤膜的细胞数量较多。

2. Western blot结果显示Snail、Slug和N-cadherin的蛋白表达水平较高，而E-cadherin的蛋白表达水平较低。

这表明细胞侵袭转移相关的转录因子和黏附分子表达异常。

3. Real-time PCR结果进一步证实了上述结果，Snail、Slug和N-cadherin的mRNA水平较高，而E-cadherin的mRNA水平较低。

Transwell侵袭实验总结第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1.Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

一、实验目的1. 了解细胞侵袭的基本原理和实验方法。

2. 观察并分析细胞侵袭过程中的形态变化和迁移能力。

3. 探讨不同实验条件下细胞侵袭能力的差异。

二、实验原理细胞侵袭是指细胞穿越细胞外基质（ECM）进入周围组织的过程。

这一过程在肿瘤的侵袭转移、组织修复和炎症反应等生理和病理过程中具有重要意义。

细胞侵袭能力的强弱取决于细胞与ECM的相互作用以及细胞内信号转导途径的激活。

本实验采用Transwell小室法，通过观察细胞在ECM上的迁移和侵袭能力，评估细胞的侵袭能力。

三、实验材料1. 细胞：肿瘤细胞系A和正常细胞系B。

2. ECM：胶原蛋白I型、IV型。

3. Transwell小室：8μm孔径。

4. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清。

5. 细胞培养试剂：青霉素、链霉素。

6. 实验仪器：倒置显微镜、图像分析系统、离心机、培养箱等。

四、实验方法1. 细胞培养：将肿瘤细胞系A和正常细胞系B接种于6孔板，培养至对数生长期。

2. ECM包被：将Transwell小室的上室铺上胶原蛋白I型和IV型ECM，下室加入DMEM培养基。

3. 细胞侵袭实验：将细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入含有胎牛血清的DMEM培养基，培养24小时。

4. 洗涤：用PBS洗涤Transwell小室，去除未侵袭的细胞。

5. 染色：用结晶紫染色细胞，用吸水纸吸去多余染液。

6. 图像分析：在倒置显微镜下观察侵袭细胞，并使用图像分析系统计算侵袭细胞数。

五、实验结果1. 肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B。

2. 随着ECM浓度的增加，肿瘤细胞系A的侵袭能力逐渐减弱。

3. 在不同实验条件下，肿瘤细胞系A的侵袭能力存在显著差异。

六、讨论本实验结果表明，肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B，这可能与肿瘤细胞系A的ECM受体表达和信号转导途径的激活有关。

此外，ECM浓度对肿瘤细胞系A的侵袭能力具有调节作用，提示ECM在肿瘤侵袭转移过程中可能起到关键作用。

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

Transwell 侵袭实验一、实验原理将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

二、实验步骤1.将基质胶、Ep管、培养基、已放Transwell小室的24孔板提前放4℃预冷。

2.在冰上，基质胶：培养基= 1:8，预冷Ep管分别加106µl培养基+13.3µl基质胶（100µl/孔，配120µl）。

3.小室上孔迅速加100µl稀释的胶（垂直加入，铺平），37℃孵育1h，待胶凝固。

4.取适量细胞，离心后用无血清培养基重悬，上室加100µl。

（细胞接种数应该通过预实验确定）5.下室加入600µl含10% FBS的培养基。

6.37℃孵育24 h。

7.弃去上室内培养基，用棉签拭去上室残留的细胞，特别是边缘，棉签弄尖沿壁转一圈。

8.下室加600µl 4%多聚甲醛固定20min，PBS洗1-2遍，干燥。

9.下室加入400µl 0.1%结晶紫，染色10min10.PBS洗去残留染液。

11.将小室置于倒置显微镜下，观察拍照，取上、下、左、右、中五个视野计数，求平均值。

注：1.提前30min开制冰机。

2.拿小室时拿边缘，加基质胶时垂直加。

禁止在实际上方操作，准备好东西再配胶。

3.0.1%结晶紫：2.5%结晶紫配制成0.1%结晶紫溶液，400µl至10mL。

上室：采用无血清培养基，为维持细胞活性，可加入低浓度培养基，如2%或者5%。

下室：5%-10%FBS培养基，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。

1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。

ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。

ﻫ２。

3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。

其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。

由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。

在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。

肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。

最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。

Transwell实验的具体操作步骤如下：1.实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。

同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。

2.基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。

铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。

3.细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。

4.接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。

5.添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。

6.培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。

Transwell 小室细胞侵袭实验1）提前接种细胞并对细胞做不同处理（如转染或加药）。

此处选取1640培养基，具体情况视细胞种类不同而定。

2）接种前，将matrigel从-20℃取出，于4℃冰箱过夜融化。

之后每transwell 小室加入10μL matrigel胶与60μL 1640培养基混合物，在细胞培养箱中放置30 min-2h 使胶凝固。

3）胰酶消化对数期细胞，2 mL含血清培养基终止消化。

将细胞悬液转移到离心管中。

4）1000 rpm离心3 min使细胞沉积于管底，离心期间配制含1%血清的1640培养基。

5）弃去上清培养基，将细胞重悬于含1%血清的1640培养基，1000 rpm离心3 min。

6）之后再用含1%血清的1640培养基轻轻吹打混匀细胞，用血细胞计数板对细胞计数。

7）根据细胞计数结果计算细胞密度，将细胞稀释到1×105个/mL。

8）在24孔板中加入600 μL 含10%血清的1640培养基，放入Transwell小室，在Transwell小室中加入100 μL细胞悬液。

9）细胞培养箱培养48-72小时。

10）准备新的24孔板，加入600 μL/孔的PBS；从培养箱中取出24孔板，用棉签擦去上层细胞，将Transwell小室浸入PBS中，重复洗3次，注意动作轻柔，不要把下层细胞洗掉。

11）在新的24孔板中加入600 μl/孔的甲醇，将Transwell小室浸入甲醇中10 min，固定细胞。

12）将Transwell小室重新用PBS洗3次。

13）在新的24孔板中加入600μl/孔的DAPI，将Transwell小室浸入DAPI中5min，染色细胞核。

14）将Transwell小室重新用PBS洗3次。

15）在荧光倒置显微镜下拍摄穿过Transwell小室的细胞，每个小室随机选取8-10个视野拍摄并对细胞计数，计算平均数，比较不同处理对细胞迁移能力的影响。

第1篇一、引言细胞侵袭是肿瘤发生发展过程中的关键步骤，也是肿瘤转移的先导环节。

为了研究肿瘤细胞的侵袭能力，本研究通过细胞侵袭实验，收集了不同处理条件下肿瘤细胞的侵袭数据。

本报告将对这些数据进行分析，旨在揭示肿瘤细胞侵袭能力的变化规律及其影响因素。

二、实验方法1. 细胞培养本研究选用人肺腺癌细胞系A549作为实验对象，将其接种于6孔板中，进行常规培养。

2. 细胞处理将A549细胞分为实验组和对照组，实验组采用不同浓度的药物进行处理，对照组采用等体积的溶剂进行处理。

3. 细胞侵袭实验采用Transwell小室进行细胞侵袭实验，将处理后的细胞接种于Transwell小室的上室，下室加入含有基质胶的培养基。

孵育一定时间后，取出小室，用棉签轻轻擦去未侵袭的细胞，用4%的甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下观察并计数侵袭细胞。

4. 数据分析采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，包括描述性统计、t检验、方差分析等。

三、结果与分析1. 细胞侵袭能力的变化（1）实验组细胞侵袭能力显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够增强肿瘤细胞的侵袭能力。

（2）随着药物浓度的增加，细胞侵袭能力逐渐增强（P<0.05），说明药物处理对细胞侵袭能力的影响呈剂量依赖性。

2. 影响细胞侵袭能力的因素（1）细胞周期：通过流式细胞术检测实验组和对照组细胞的周期分布，发现实验组细胞G2/M期比例显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够促进细胞周期向G2/M期转变，进而增强细胞侵袭能力。

（2）细胞黏附：通过检测实验组和对照组细胞的黏附能力，发现实验组细胞黏附能力显著低于对照组（P<0.05），说明药物处理能够降低细胞黏附能力，从而增强细胞侵袭能力。

（3）细胞骨架：通过免疫荧光技术检测实验组和对照组细胞骨架蛋白的表达，发现实验组细胞骨架蛋白的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够增强细胞骨架蛋白的表达，进而增强细胞侵袭能力。

细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验原理步骤详解细胞悬液100－200μL 加⼊上室，最后放⼊培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能⼒⽽定）。

今天主要介绍常⽤的细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验的原理和步骤⽅法。

和细胞划痕实验相⽐Transwell实验相对复杂⼀些，在实验过程中往往会出现各种问题，下⾯我们就⼀起来探讨下transwell侵袭实验中需要注意的⼀些细节！⾸先我们来看下图肿瘤细胞转移的5个主要过程，以便于对肿瘤侵袭和转移有个更加清晰的认识。

肿瘤细胞转移过程其中细胞侵袭便发⽣在第⼀步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进⼊⾎管、淋巴管的过程，后期才开始进⾏转移。

本期我们就为⼤家讲述利⽤transwell⼩室模拟细胞侵袭的实验⽅法。

Transwell侵袭实验的原理和过程transwell原理简单来说，将transwell⼩室放⼊培养板中，并将⾼营养液与低营养液⽤⼀层膜隔开，细胞放在低营养液中，⽽为了获更多的营养，细胞则会穿过这层膜，进⼊⾼营养液。

细胞transwell实验，可作为⼀种⾮常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的⽅法。

transwell⼩室的结构⽰意图如下左图；下右图为利⽤⾎清为诱导因⼦，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。

简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有⾎清培养基。

这样细胞放⽆⾎清的培养基⾥，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才⾏。

此时膜上涂⼀层基质胶，就可模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能⼒。

Transwell侵袭实验的具体步骤⼀、实验材料（提前1天准备）a）Transwell⼩室b）基质胶：常⽤的是⼈⼯重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。

因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。

它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

HEPG2细胞做侵袭实验细节Transwell 侵袭实验原理Transwell 侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。

它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。

今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。

我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。

而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。

Transwell 小知识②上层培养液：上层培养液采用低血清或无血清培养基，为维持渗透压。

⑤下层培养液：下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

下层也可用趋化因子，比如纤维粘连蛋白。

④基质胶：聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司、sigma叫ECM。

是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。

如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel 就不需要购买了。

实验步骤（1）基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；（2）基质胶使用：上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul)60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好，放入37℃培养箱中，孵育1-5h（<5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态;(注意：铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。

transwell实验原理与步骤Transwell实验是一种常见的细胞迁移和侵袭性研究的方法。

它广泛用于评估细胞的迁移能力、侵袭能力以及药物对这些能力的影响。

Transwell实验基于孔板中半透膜的整体设计，使得细胞可以在孔板上的上下两侧进行迁移和侵袭。

下面将详细介绍Transwell实验的原理和步骤。

1. Transwell实验的原理Transwell实验中使用的是Transwell孔板，该孔板由上下两个室组成，通过半透膜分隔开。

半透膜通常由聚碳酸酯或聚膠（polyethylene terephthalate）制成，具有特定的孔径。

孔板上室称为上室，下室称为下室。

上室用于装载待测的细胞，下室则添加诱导迁移或侵袭的化学物质。

Transwell实验的原理是利用孔板的半透膜，使得细胞可以通过孔板上下两侧进行迁移和侵袭。

细胞在上室中培养，通过半透膜向下室中迁移和侵袭。

迁移和侵袭的细胞数量可以通过染色或其他方法来定量。

同时，可以添加不同的化学物质于上室或下室，以评估这些化学物质对细胞迁移和侵袭能力的影响。

2. Transwell实验的步骤Transwell实验的步骤主要包括预处理Transwell孔板、细胞培养、细胞处理、迁移或侵袭实验、染色和结果分析。

(1) 预处理Transwell孔板将Transwell孔板放入含有适当的细胞培养基的无菌培养皿中，在37℃的恒温培养箱中预温30分钟。

然后，将细胞培养基完全移除并在烘箱中干燥。

(2)细胞培养将需要进行迁移和侵袭实验的细胞培养至合适的数量和状态。

注意要保持细胞处于对下一步实验的最佳状态，例如在对照组、实验组之间生长均匀。

(3)细胞处理将预处理后的Transwell孔板放入一个无菌培养皿中。

然后，向上室中加入适当数量的细胞悬液。

根据实验要求，可以在上室中添加不同浓度的细胞。

(4)迁移或侵袭实验在下室中加入化学物质，例如诱导剂或特定药物。

这些化学物质可以模拟体内环境，刺激细胞的迁移或侵袭能力。

Transwell用于迁移实验和侵袭实验的方法Transwell用于细胞迁移实验和侵袭实验的不同:对于肿瘤细胞而言，迁移看的是肿瘤细胞迁移的快慢和程度。

而肿瘤细胞侵袭是肿瘤细胞进行迁移它就必须分泌金属蛋白MMP9，而基质胶的作用相当于模拟人体类的基质。

方法：1 Transwell实验检测新鱼腥草素钠对食管癌细胞迁移的影响（1）取对数生长期的Kyse-450、Eca-109和TE1细胞，消化、离心、重悬并进行细胞计数，调整细胞浓度为1×105/mL；（2）100μL细胞悬液接种于transwell上室。

（注意上室的细胞悬液中不含血清）；（3）添加600μL FBS含量为20%的完全培养基于下室；（4）设置对照组及实验组，实验组药物加于transwell上室中，Kyse-450细胞系药物终浓度为0、100、200、300μg/mL，培养24h；Eca-109、TE1两种细胞系药物终浓度为0、50、100、200μg/mL；（5）24h后，将上室和下室的液体吸出，PBS清洗上室两遍。

使用松软的棉花去除小室内细胞，即未穿透过小室的细胞；（6）4%甲醛固定上室穿透过的细胞，固定15min；（7）固定过后，风干上室10min，用0.5%结晶紫染色20min；（8）PBS清洗3遍，从边缘吸干水分，拍照记录，每个小室随机拍摄5个位置，每个实验重复3次。

2Transwell检测细胞侵袭2.1 Matrigel胶分装处理（1）将Matrigel基质胶放于冰盒，再同冰盒一起放在4℃冰箱的里面，过夜融化，随时观看瓶中的基质胶状态，确认基质胶完全融化；（2）根据实验需求计算出一次的价值叫用量进行分装，在分装时与Matrigel胶接触的全部用品均需预冷，所有操作过程在冰上低温无菌操作，分装放置在－80℃冰箱，保留货号，不能重复冻融使用；（3）当胶浓度＜3mg/mL时，不会成胶；（4）融化后的Matrigel胶为澄清液体。

Transwell细胞迁移与侵袭实验服务：细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

细胞增殖与毒性检测MTT检测实验服务：原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

MTT方法用于判断药物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用，以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞活力、增殖、凋亡等方面）。

细胞增殖与毒性检测SRB检测实验服务：磺酰罗丹明是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中的量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。

在515nm波长处的OD值与活细胞数呈良好的线性关系。

SRB法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

细胞增殖与毒性检测CCK-8检测实验服务：Cell Counting Kit简称CCK8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。

颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。