细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。

24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)实验介绍：细胞迁移和侵袭实验是通过将Transwell小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，研究细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜下的共培养、细胞趋化、细胞迁移和侵袭等多种方面的实验。

实验步骤：1.材料准备：可拍照显微镜、Transwell小室（孔径8μm，没包被胶的），24孔板、BD公司的Matrigel、无血清DMEM、(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基、DMEM完全培养基、1640完全培养基（也可加到20%血清）、无菌PBS、棉签、胰酶、4%多聚甲醛固定液或者甲醇、结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）。

2.实验步骤：2.1 基质胶铺板：用XXX的Matrigel稀释1：8，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2 制备细胞悬液：细胞撤血清饥饿12-24小时后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3 接种细胞：取细胞悬液100µl加入Transwell小室，24孔板下室加入600µl含20%FBS的培养基。

注意避免气泡的产生。

2.4 培养细胞：常规培养12-48小时。

24小时较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

2.5 结果统计：通过给细胞染色，在镜下计数细胞。

胞悬液；将细胞悬液加入上室中央，保持液面水平；将下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基；37℃培养箱中孵育20-24小时；取出transwell，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色；用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

注意事项包括确保transwell在24孔板中浸泡1小时，消化细胞时用无血清培养基洗涤2次并计数，将细胞悬液加入上室中央保持液面水平，下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基，37℃培养箱中孵育20-24小时，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色，用棉球擦去上表面细胞，并小心避免混淆实验组和对照组。

细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

细胞侵袭转移实验报告细胞侵袭转移是癌症进展和转移的重要特征之一。

了解细胞的侵袭转移机制对于癌症预防和治疗具有重要意义。

本实验旨在研究细胞的侵袭转移能力，并探究其相关机制。

实验过程如下：1. 细胞培养与处理：选取一种具有侵袭能力的癌细胞株，如乳腺癌细胞MCF-7。

将细胞培养在含有适当营养和生长因子的培养基中，经过传代培养至适当细胞数目。

2. Transwell侵袭实验：将含有细胞的培养基加入到上游腔室中，下游腔室中加入含有化膜毛细孔的过滤膜，如Matrigel。

使细胞逐渐通过过滤膜向下游腔室侵袭。

培养一定时间后，取出过滤膜并使用染色剂染色，以观察和计数通过膜孔的细胞数量。

3. Western blot分析：用Western blot方法检测有关侵袭转移的分子标志物，如转录因子Snail和转录因子Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，转移至聚乙烯二醇膜上，用特异性抗体与目标蛋白结合。

通过免疫反应，使用化学发光显色剂检测目标蛋白的表达水平。

4. Real-time PCR分析：通过Real-time PCR技术检测相关基因的mRNA水平，包括Snail、Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取总RNA，逆转录为cDNA 后，用特异性引物进行PCR扩增。

通过观察PCR曲线和计算Ct值，比较各样本基因表达水平的差异。

实验结果如下：1. Transwell侵袭实验表明MCF-7细胞具有较强的侵袭能力。

染色显示通过过滤膜的细胞数量较多。

2. Western blot结果显示Snail、Slug和N-cadherin的蛋白表达水平较高，而E-cadherin的蛋白表达水平较低。

这表明细胞侵袭转移相关的转录因子和黏附分子表达异常。

3. Real-time PCR结果进一步证实了上述结果，Snail、Slug和N-cadherin的mRNA水平较高，而E-cadherin的mRNA水平较低。

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)迁移实验〔cell migration assay〕实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤： 1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning 公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购置的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基〔也可加到20%血清〕，无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液〔0.1%〔g/ml〕PBS结晶紫〕 2步骤和流程 2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8〔根据细胞产生mmp的量来决定〕稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，〔用PBS洗1－2遍〕，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100μl参加Transwell小室。

②24孔板下室一般参加600μl含20?S的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

transwell侵袭实验原理及步骤展开全文transwell侵袭实验就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，细胞会往高营养的培养液方向移动。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

transwell侵袭实验内容：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

常用0.4、3.0µm。

我们实验室用的是0.4µm。

将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

（3）肿瘤细胞迁移实验常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

（4）肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。

在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子，细胞会分泌相关酶类消化模拟细胞外基质膜的基质胶，从而从上室迁移到下室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

Transwell 侵袭实验一、实验原理将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

二、实验步骤1.将基质胶、Ep管、培养基、已放Transwell小室的24孔板提前放4℃预冷。

2.在冰上，基质胶：培养基= 1:8，预冷Ep管分别加106µl培养基+13.3µl基质胶（100µl/孔，配120µl）。

3.小室上孔迅速加100µl稀释的胶（垂直加入，铺平），37℃孵育1h，待胶凝固。

4.取适量细胞，离心后用无血清培养基重悬，上室加100µl。

（细胞接种数应该通过预实验确定）5.下室加入600µl含10% FBS的培养基。

6.37℃孵育24 h。

7.弃去上室内培养基，用棉签拭去上室残留的细胞，特别是边缘，棉签弄尖沿壁转一圈。

8.下室加600µl 4%多聚甲醛固定20min，PBS洗1-2遍，干燥。

9.下室加入400µl 0.1%结晶紫，染色10min10.PBS洗去残留染液。

11.将小室置于倒置显微镜下，观察拍照，取上、下、左、右、中五个视野计数，求平均值。

注：1.提前30min开制冰机。

2.拿小室时拿边缘，加基质胶时垂直加。

禁止在实际上方操作，准备好东西再配胶。

3.0.1%结晶紫：2.5%结晶紫配制成0.1%结晶紫溶液，400µl至10mL。

上室：采用无血清培养基，为维持细胞活性，可加入低浓度培养基，如2%或者5%。

下室：5%-10%FBS培养基，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。

1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。

ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。

ﻫ２。

3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。

其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。

由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。

在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。

肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。

最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。

Transwell实验的具体操作步骤如下：1.实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。

同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。

2.基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。

铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。

3.细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。

4.接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。

5.添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。

6.培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。

Transwell 小室细胞侵袭实验1）提前接种细胞并对细胞做不同处理（如转染或加药）。

此处选取1640培养基，具体情况视细胞种类不同而定。

2）接种前，将matrigel从-20℃取出，于4℃冰箱过夜融化。

之后每transwell 小室加入10μL matrigel胶与60μL 1640培养基混合物，在细胞培养箱中放置30 min-2h 使胶凝固。

3）胰酶消化对数期细胞，2 mL含血清培养基终止消化。

将细胞悬液转移到离心管中。

4）1000 rpm离心3 min使细胞沉积于管底，离心期间配制含1%血清的1640培养基。

5）弃去上清培养基，将细胞重悬于含1%血清的1640培养基，1000 rpm离心3 min。

6）之后再用含1%血清的1640培养基轻轻吹打混匀细胞，用血细胞计数板对细胞计数。

7）根据细胞计数结果计算细胞密度，将细胞稀释到1×105个/mL。

8）在24孔板中加入600 μL 含10%血清的1640培养基，放入Transwell小室，在Transwell小室中加入100 μL细胞悬液。

9）细胞培养箱培养48-72小时。

10）准备新的24孔板，加入600 μL/孔的PBS；从培养箱中取出24孔板，用棉签擦去上层细胞，将Transwell小室浸入PBS中，重复洗3次，注意动作轻柔，不要把下层细胞洗掉。

11）在新的24孔板中加入600 μl/孔的甲醇，将Transwell小室浸入甲醇中10 min，固定细胞。

12）将Transwell小室重新用PBS洗3次。

13）在新的24孔板中加入600μl/孔的DAPI，将Transwell小室浸入DAPI中5min，染色细胞核。

14）将Transwell小室重新用PBS洗3次。

15）在荧光倒置显微镜下拍摄穿过Transwell小室的细胞，每个小室随机选取8-10个视野拍摄并对细胞计数，计算平均数，比较不同处理对细胞迁移能力的影响。

细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验原理步骤详解细胞悬液100－200μL 加⼊上室，最后放⼊培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能⼒⽽定）。

今天主要介绍常⽤的细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验的原理和步骤⽅法。

和细胞划痕实验相⽐Transwell实验相对复杂⼀些，在实验过程中往往会出现各种问题，下⾯我们就⼀起来探讨下transwell侵袭实验中需要注意的⼀些细节！⾸先我们来看下图肿瘤细胞转移的5个主要过程，以便于对肿瘤侵袭和转移有个更加清晰的认识。

肿瘤细胞转移过程其中细胞侵袭便发⽣在第⼀步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进⼊⾎管、淋巴管的过程，后期才开始进⾏转移。

本期我们就为⼤家讲述利⽤transwell⼩室模拟细胞侵袭的实验⽅法。

Transwell侵袭实验的原理和过程transwell原理简单来说，将transwell⼩室放⼊培养板中，并将⾼营养液与低营养液⽤⼀层膜隔开，细胞放在低营养液中，⽽为了获更多的营养，细胞则会穿过这层膜，进⼊⾼营养液。

细胞transwell实验，可作为⼀种⾮常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的⽅法。

transwell⼩室的结构⽰意图如下左图；下右图为利⽤⾎清为诱导因⼦，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。

简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有⾎清培养基。

这样细胞放⽆⾎清的培养基⾥，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才⾏。

此时膜上涂⼀层基质胶，就可模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能⼒。

Transwell侵袭实验的具体步骤⼀、实验材料（提前1天准备）a）Transwell⼩室b）基质胶：常⽤的是⼈⼯重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。

因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。

它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

transwell实验原理与步骤Transwell实验是一种常见的细胞迁移和侵袭性研究的方法。

它广泛用于评估细胞的迁移能力、侵袭能力以及药物对这些能力的影响。

Transwell实验基于孔板中半透膜的整体设计，使得细胞可以在孔板上的上下两侧进行迁移和侵袭。

下面将详细介绍Transwell实验的原理和步骤。

1. Transwell实验的原理Transwell实验中使用的是Transwell孔板，该孔板由上下两个室组成，通过半透膜分隔开。

半透膜通常由聚碳酸酯或聚膠（polyethylene terephthalate）制成，具有特定的孔径。

孔板上室称为上室，下室称为下室。

上室用于装载待测的细胞，下室则添加诱导迁移或侵袭的化学物质。

Transwell实验的原理是利用孔板的半透膜，使得细胞可以通过孔板上下两侧进行迁移和侵袭。

细胞在上室中培养，通过半透膜向下室中迁移和侵袭。

迁移和侵袭的细胞数量可以通过染色或其他方法来定量。

同时，可以添加不同的化学物质于上室或下室，以评估这些化学物质对细胞迁移和侵袭能力的影响。

2. Transwell实验的步骤Transwell实验的步骤主要包括预处理Transwell孔板、细胞培养、细胞处理、迁移或侵袭实验、染色和结果分析。

(1) 预处理Transwell孔板将Transwell孔板放入含有适当的细胞培养基的无菌培养皿中，在37℃的恒温培养箱中预温30分钟。

然后，将细胞培养基完全移除并在烘箱中干燥。

(2)细胞培养将需要进行迁移和侵袭实验的细胞培养至合适的数量和状态。

注意要保持细胞处于对下一步实验的最佳状态，例如在对照组、实验组之间生长均匀。

(3)细胞处理将预处理后的Transwell孔板放入一个无菌培养皿中。

然后，向上室中加入适当数量的细胞悬液。

根据实验要求，可以在上室中添加不同浓度的细胞。

(4)迁移或侵袭实验在下室中加入化学物质，例如诱导剂或特定药物。

这些化学物质可以模拟体内环境，刺激细胞的迁移或侵袭能力。

Transwell细胞迁移与侵袭实验服务：细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

细胞增殖与毒性检测MTT检测实验服务：原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

MTT方法用于判断药物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用，以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞活力、增殖、凋亡等方面）。

细胞增殖与毒性检测SRB检测实验服务：磺酰罗丹明是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中的量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。

在515nm波长处的OD值与活细胞数呈良好的线性关系。

SRB法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

细胞增殖与毒性检测CCK-8检测实验服务：Cell Counting Kit简称CCK8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。

颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

Transwell侵袭实验操作步骤
1、实验前一天，将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，Matrigel胶即从固体状态融化为液体状态。

2、包被基底膜：Matrigel基质胶以1：8稀释后包被transwell 小室底部膜的上室面(整个过程注意冰上操作，否则Matrigel在10℃以上即会凝固)，3小时风干。

3、水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL 10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

4、常规胰酶消化细胞，PBS洗1-2遍去除血清的影响，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5*105个/mL。

5、取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室，24孔培养板下室内加入600μL 含10% FBS培养基。

注意下层培养液与小室之间不要产生气泡。

6、培养板置于37℃的CO2培养箱中，依据肿瘤细胞侵袭能力而定培养12-48h。

7、取出小室，PBS淋洗2遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min，结晶紫溶液染色15 min。

8、倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，取平均值，统计分析。

transwell统计方法Transwell统计方法是一种常用的实验技术，用于研究细胞迁移和侵袭的过程。

本文将介绍Transwell统计方法的原理、操作步骤以及其在细胞研究中的应用。

一、原理Transwell统计方法基于Transwell腔室，通过人工模拟细胞迁移和侵袭的环境，来研究细胞在不同条件下的迁移和侵袭能力。

Transwell腔室由两个隔离的腔室组成，中间隔以小孔，可以允许细胞通过。

上腔室涂有一层基底膜，用于模拟细胞迁移和侵袭的环境。

通过上腔室内细胞的迁移和侵袭情况，可以评估细胞的迁移和侵袭能力。

二、操作步骤1. 准备Transwell腔室：将Transwell腔室放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，使其浸没在培养基中。

保持腔室表面湿润。

2. 细胞处理：将需要研究的细胞分离培养，并将其洗涤至适宜的细胞密度。

3. 细胞接种：将细胞悬液加入上腔室，将上腔室放置在含有培养基的培养皿中。

保持上腔室表面湿润，并确保细胞不会溢出。

4. 添加诱导剂：根据研究需要，可以向上腔室中添加适当的诱导剂，以模拟特定的迁移和侵袭环境。

5. 培养：将培养皿放入恒温培养箱中，以适宜的温度和湿度进行培养。

根据研究需要，可以选择不同的培养时间。

6. 细胞染色：培养结束后，将上腔室中的细胞染色，以便观察和计数。

常用的染色方法有克里斯蓝染色、伊红染色等。

7. 观察和计数：使用显微镜观察上腔室中的细胞，并通过计数细胞数量来评估细胞的迁移和侵袭能力。

三、应用Transwell统计方法在细胞研究中具有广泛的应用。

主要有以下几个方面：1. 细胞迁移和侵袭的研究：通过Transwell统计方法可以评估不同细胞在不同环境条件下的迁移和侵袭能力，从而深入了解细胞的功能和机制。

2. 肿瘤转移的研究：肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征，Transwell 统计方法可以模拟肿瘤细胞在体内转移的过程，为研究肿瘤转移提供重要的工具。

3. 药物筛选和评估：Transwell统计方法可以用于评估抑制细胞迁移和侵袭的药物效果，为药物筛选和评估提供依据。