Transwell侵袭实验全面总结

细胞侵袭转移实验报告细胞侵袭转移是癌症进展和转移的重要特征之一。

了解细胞的侵袭转移机制对于癌症预防和治疗具有重要意义。

本实验旨在研究细胞的侵袭转移能力，并探究其相关机制。

实验过程如下：1. 细胞培养与处理：选取一种具有侵袭能力的癌细胞株，如乳腺癌细胞MCF-7。

将细胞培养在含有适当营养和生长因子的培养基中，经过传代培养至适当细胞数目。

2. Transwell侵袭实验：将含有细胞的培养基加入到上游腔室中，下游腔室中加入含有化膜毛细孔的过滤膜，如Matrigel。

使细胞逐渐通过过滤膜向下游腔室侵袭。

培养一定时间后，取出过滤膜并使用染色剂染色，以观察和计数通过膜孔的细胞数量。

3. Western blot分析：用Western blot方法检测有关侵袭转移的分子标志物，如转录因子Snail和转录因子Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，转移至聚乙烯二醇膜上，用特异性抗体与目标蛋白结合。

通过免疫反应，使用化学发光显色剂检测目标蛋白的表达水平。

4. Real-time PCR分析：通过Real-time PCR技术检测相关基因的mRNA水平，包括Snail、Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取总RNA，逆转录为cDNA 后，用特异性引物进行PCR扩增。

通过观察PCR曲线和计算Ct值，比较各样本基因表达水平的差异。

实验结果如下：1. Transwell侵袭实验表明MCF-7细胞具有较强的侵袭能力。

染色显示通过过滤膜的细胞数量较多。

2. Western blot结果显示Snail、Slug和N-cadherin的蛋白表达水平较高，而E-cadherin的蛋白表达水平较低。

这表明细胞侵袭转移相关的转录因子和黏附分子表达异常。

3. Real-time PCR结果进一步证实了上述结果，Snail、Slug和N-cadherin的mRNA水平较高，而E-cadherin的mRNA水平较低。

transwell侵袭实验技术原理transwell是细胞迁移的常⽤检测⽅法，细胞迁移也称为细胞爬⾏、细胞移动或细胞运动，是指
细胞在接收到迁移信或感受到某些物质的梯度后⽽产⽣的移动。

细胞迁移是正常细胞的基本功能之⼀，是机体正常⽣长发育的⽣理过程，也是活细胞普遍存在的⼀种运动形式。

Transwell实验原理：⼩室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从⽽可以研究下层培养液中的成分对细胞⽣长、运动等的影响。

Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法我们所使用的是Chemicon公司的ECM554，基质胶已经包被好了，买来就可以用，很方便,而且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大。

这种胶4度下很软,37度则变得比较坚硬，因此用前应先放在培养箱中10分钟作用，使胶完全凝固。

该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色，再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。

我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目.结晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶标仪570nm检测，同样可以反应穿过细胞数因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数，因此建议有条件的话还是买这类已经铺好胶的试剂盒,比较可靠。

说明书该公司网上可以下载，对原理也有比较详细的阐述，可以去查一下.我们做的时候，上室用0.5％BSA的培养液，下室用5%血清的培养液,下室血清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整,如果细胞侵袭能力强,可适当降低血清浓度,否则可适当提高血清浓度。

需要注意的是：1。

上室内的细胞数目要适当，过多,穿过膜的细胞会过多过快，如果用计数法的话将难以计数；最少也要保证在收样的时候，上室内还要有细胞存在。

具体细胞密度需要自己摸索。

2。

细胞计数的准确性对结果影响很大，各组间最好不要分开计数.尽量用同一密度的细胞悬液给予不同处理,保证各组细胞量一致3.对细胞的处理不可影响细胞生存。

否则难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能力改变侵袭小室其实不止是transwell的,其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。

我用过Thincert,个人感觉不错,而且价格便宜,是grelner的,孔径8微米用于24孔板的一个才45块人民币，而且可以零买,不想transwell,总是一箱一箱的卖,实在是太贵了!侵袭实验要结合实验目的,不一定非要包被的。

下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤(摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert™ cell culture inserts》，大家如需要,可用google搜之：1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures2。

Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。

1．实验用品：Transwell小室：多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。

BD也有已包被好的，价格不清楚。

Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。

linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验。

iceyxy战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。

梅林战友提供的BD价格： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。

liguofan说国产的boyden30块一个。

jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。

平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。

一、实验目的1. 了解细胞侵袭的基本原理和实验方法。

2. 观察并分析细胞侵袭过程中的形态变化和迁移能力。

3. 探讨不同实验条件下细胞侵袭能力的差异。

二、实验原理细胞侵袭是指细胞穿越细胞外基质（ECM）进入周围组织的过程。

这一过程在肿瘤的侵袭转移、组织修复和炎症反应等生理和病理过程中具有重要意义。

细胞侵袭能力的强弱取决于细胞与ECM的相互作用以及细胞内信号转导途径的激活。

本实验采用Transwell小室法，通过观察细胞在ECM上的迁移和侵袭能力，评估细胞的侵袭能力。

三、实验材料1. 细胞：肿瘤细胞系A和正常细胞系B。

2. ECM：胶原蛋白I型、IV型。

3. Transwell小室：8μm孔径。

4. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清。

5. 细胞培养试剂：青霉素、链霉素。

6. 实验仪器：倒置显微镜、图像分析系统、离心机、培养箱等。

四、实验方法1. 细胞培养：将肿瘤细胞系A和正常细胞系B接种于6孔板，培养至对数生长期。

2. ECM包被：将Transwell小室的上室铺上胶原蛋白I型和IV型ECM，下室加入DMEM培养基。

3. 细胞侵袭实验：将细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入含有胎牛血清的DMEM培养基，培养24小时。

4. 洗涤：用PBS洗涤Transwell小室，去除未侵袭的细胞。

5. 染色：用结晶紫染色细胞，用吸水纸吸去多余染液。

6. 图像分析：在倒置显微镜下观察侵袭细胞，并使用图像分析系统计算侵袭细胞数。

五、实验结果1. 肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B。

2. 随着ECM浓度的增加，肿瘤细胞系A的侵袭能力逐渐减弱。

3. 在不同实验条件下，肿瘤细胞系A的侵袭能力存在显著差异。

六、讨论本实验结果表明，肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B，这可能与肿瘤细胞系A的ECM受体表达和信号转导途径的激活有关。

此外，ECM浓度对肿瘤细胞系A的侵袭能力具有调节作用，提示ECM在肿瘤侵袭转移过程中可能起到关键作用。

Transwell 侵袭实验一、实验原理将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

二、实验步骤1.将基质胶、Ep管、培养基、已放Transwell小室的24孔板提前放4℃预冷。

2.在冰上，基质胶：培养基= 1:8，预冷Ep管分别加106µl培养基+13.3µl基质胶（100µl/孔，配120µl）。

3.小室上孔迅速加100µl稀释的胶（垂直加入，铺平），37℃孵育1h，待胶凝固。

4.取适量细胞，离心后用无血清培养基重悬，上室加100µl。

（细胞接种数应该通过预实验确定）5.下室加入600µl含10% FBS的培养基。

6.37℃孵育24 h。

7.弃去上室内培养基，用棉签拭去上室残留的细胞，特别是边缘，棉签弄尖沿壁转一圈。

8.下室加600µl 4%多聚甲醛固定20min，PBS洗1-2遍，干燥。

9.下室加入400µl 0.1%结晶紫，染色10min10.PBS洗去残留染液。

11.将小室置于倒置显微镜下，观察拍照，取上、下、左、右、中五个视野计数，求平均值。

注：1.提前30min开制冰机。

2.拿小室时拿边缘，加基质胶时垂直加。

禁止在实际上方操作，准备好东西再配胶。

3.0.1%结晶紫：2.5%结晶紫配制成0.1%结晶紫溶液，400µl至10mL。

上室：采用无血清培养基，为维持细胞活性，可加入低浓度培养基，如2%或者5%。

下室：5%-10%FBS培养基，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

第1篇一、引言细胞侵袭是肿瘤发生发展过程中的关键步骤，也是肿瘤转移的先导环节。

为了研究肿瘤细胞的侵袭能力，本研究通过细胞侵袭实验，收集了不同处理条件下肿瘤细胞的侵袭数据。

本报告将对这些数据进行分析，旨在揭示肿瘤细胞侵袭能力的变化规律及其影响因素。

二、实验方法1. 细胞培养本研究选用人肺腺癌细胞系A549作为实验对象，将其接种于6孔板中，进行常规培养。

2. 细胞处理将A549细胞分为实验组和对照组，实验组采用不同浓度的药物进行处理，对照组采用等体积的溶剂进行处理。

3. 细胞侵袭实验采用Transwell小室进行细胞侵袭实验，将处理后的细胞接种于Transwell小室的上室，下室加入含有基质胶的培养基。

孵育一定时间后，取出小室，用棉签轻轻擦去未侵袭的细胞，用4%的甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下观察并计数侵袭细胞。

4. 数据分析采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，包括描述性统计、t检验、方差分析等。

三、结果与分析1. 细胞侵袭能力的变化（1）实验组细胞侵袭能力显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够增强肿瘤细胞的侵袭能力。

（2）随着药物浓度的增加，细胞侵袭能力逐渐增强（P<0.05），说明药物处理对细胞侵袭能力的影响呈剂量依赖性。

2. 影响细胞侵袭能力的因素（1）细胞周期：通过流式细胞术检测实验组和对照组细胞的周期分布，发现实验组细胞G2/M期比例显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够促进细胞周期向G2/M期转变，进而增强细胞侵袭能力。

（2）细胞黏附：通过检测实验组和对照组细胞的黏附能力，发现实验组细胞黏附能力显著低于对照组（P<0.05），说明药物处理能够降低细胞黏附能力，从而增强细胞侵袭能力。

（3）细胞骨架：通过免疫荧光技术检测实验组和对照组细胞骨架蛋白的表达，发现实验组细胞骨架蛋白的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够增强细胞骨架蛋白的表达，进而增强细胞侵袭能力。

细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验原理步骤详解细胞悬液100－200μL 加⼊上室，最后放⼊培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能⼒⽽定）。

今天主要介绍常⽤的细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验的原理和步骤⽅法。

和细胞划痕实验相⽐Transwell实验相对复杂⼀些，在实验过程中往往会出现各种问题，下⾯我们就⼀起来探讨下transwell侵袭实验中需要注意的⼀些细节！⾸先我们来看下图肿瘤细胞转移的5个主要过程，以便于对肿瘤侵袭和转移有个更加清晰的认识。

肿瘤细胞转移过程其中细胞侵袭便发⽣在第⼀步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进⼊⾎管、淋巴管的过程，后期才开始进⾏转移。

本期我们就为⼤家讲述利⽤transwell⼩室模拟细胞侵袭的实验⽅法。

Transwell侵袭实验的原理和过程transwell原理简单来说，将transwell⼩室放⼊培养板中，并将⾼营养液与低营养液⽤⼀层膜隔开，细胞放在低营养液中，⽽为了获更多的营养，细胞则会穿过这层膜，进⼊⾼营养液。

细胞transwell实验，可作为⼀种⾮常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的⽅法。

transwell⼩室的结构⽰意图如下左图；下右图为利⽤⾎清为诱导因⼦，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。

简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有⾎清培养基。

这样细胞放⽆⾎清的培养基⾥，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才⾏。

此时膜上涂⼀层基质胶，就可模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能⼒。

Transwell侵袭实验的具体步骤⼀、实验材料（提前1天准备）a）Transwell⼩室b）基质胶：常⽤的是⼈⼯重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。

因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。

它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

Transwell侵袭实验总结－Transwell的其他应用的实验步骤1．Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。

个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。

我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。

另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．Transwell上皮细胞培养步骤做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1). 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。

(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。

(4). 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。

(5). 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片3. Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

HEPG2细胞做侵袭实验细节Transwell 侵袭实验原理Transwell 侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。

它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。

今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。

我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。

而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。

Transwell 小知识②上层培养液：上层培养液采用低血清或无血清培养基，为维持渗透压。

⑤下层培养液：下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

下层也可用趋化因子，比如纤维粘连蛋白。

④基质胶：聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司、sigma叫ECM。

是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。

如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel 就不需要购买了。

实验步骤（1）基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；（2）基质胶使用：上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul)60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好，放入37℃培养箱中，孵育1-5h（<5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态;(注意：铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。

Transwell用于迁移实验和侵袭实验的方法Transwell用于细胞迁移实验和侵袭实验的不同:对于肿瘤细胞而言，迁移看的是肿瘤细胞迁移的快慢和程度。

而肿瘤细胞侵袭是肿瘤细胞进行迁移它就必须分泌金属蛋白MMP9，而基质胶的作用相当于模拟人体类的基质。

方法：1 Transwell实验检测新鱼腥草素钠对食管癌细胞迁移的影响（1）取对数生长期的Kyse-450、Eca-109和TE1细胞，消化、离心、重悬并进行细胞计数，调整细胞浓度为1×105/mL；（2）100μL细胞悬液接种于transwell上室。

（注意上室的细胞悬液中不含血清）；（3）添加600μL FBS含量为20%的完全培养基于下室；（4）设置对照组及实验组，实验组药物加于transwell上室中，Kyse-450细胞系药物终浓度为0、100、200、300μg/mL，培养24h；Eca-109、TE1两种细胞系药物终浓度为0、50、100、200μg/mL；（5）24h后，将上室和下室的液体吸出，PBS清洗上室两遍。

使用松软的棉花去除小室内细胞，即未穿透过小室的细胞；（6）4%甲醛固定上室穿透过的细胞，固定15min；（7）固定过后，风干上室10min，用0.5%结晶紫染色20min；（8）PBS清洗3遍，从边缘吸干水分，拍照记录，每个小室随机拍摄5个位置，每个实验重复3次。

2Transwell检测细胞侵袭2.1 Matrigel胶分装处理（1）将Matrigel基质胶放于冰盒，再同冰盒一起放在4℃冰箱的里面，过夜融化，随时观看瓶中的基质胶状态，确认基质胶完全融化；（2）根据实验需求计算出一次的价值叫用量进行分装，在分装时与Matrigel胶接触的全部用品均需预冷，所有操作过程在冰上低温无菌操作，分装放置在－80℃冰箱，保留货号，不能重复冻融使用；（3）当胶浓度＜3mg/mL时，不会成胶；（4）融化后的Matrigel胶为澄清液体。

Transwell侵袭实验全面总结第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable suppo rts）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

Transwell侵袭实验全面总结第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable sup ports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwel l小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

Transwell侵袭实验1.实验前一天将ECM胶（8-12 mg/ml）（Sigma）放于4℃冰箱中融化过夜2.实验时将所用的枪头在冰上预冷半个小时，ECM胶用预冷的无血清1640按1：9稀释（稀释至1mg/ml），每孔中加入稀释好的ECM胶40μl，放入37℃培养箱中，孵育5h3.水化基底膜：吸出小室中残余液体，每孔加入70ul含无血清1640培养液，37℃，30min，吸去培养基4.对数生长期的细胞，胰酶消化细胞，0.1%血清1640悬浮，计数，稀释至密度为1 106/ml，每空中加200μl细胞悬液5.24孔板下室一般加入600µl含30%新生牛血清的1640培养基6.24h后，弃去孔中培液，PBS洗2遍，甲醇固定20分钟，0.1%结晶紫染色15-20 min，用清水洗3遍以上，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞7.400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数个人觉得做Transwell就像小马过河一样，要讲究个体化，不同的细胞侵袭能力不同，胶的稀释倍数、细胞上样量、上下室血清浓度差以及孵育时间也不同。

对于你的问题，我觉的不管是在温箱中放5个小时或者是在超静工作台中风干，其主要目的是为了让Matrigel从液体状变成胶冻状，在温箱中放置5个小时后，拿出来上室中肯定会有液体残留，此时一定要将残留的液体洗干净，然后在水化一下基底膜。

(1) 吸去培养液，用棉签轻轻擦除上室聚碳酸酯膜内侧面贴壁细胞，用0.01MPBS 漂洗两次，4%多聚甲醛固定10 分钟；(2) 吸去固定液，将膜风干，每孔加0.6ml 0.1%结晶紫染液，室温中放置20 分钟；(3) 轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将上室取出，从聚碳酸酯膜内侧面用吸水纸吸干水分，自然干燥；(4) 测定前，将各实验组上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6ml 33％醋酸脱色，充分振荡，每组设定5 复孔；同时设置调零孔（33％醋酸）；比色：每孔取脱色液150μl 加入96 孔板中，在570nm 处测定OD 值。

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2. 实现销售业绩同比增长20%。

3. 提升客户满意度，增加老客户复购率。

4. 加强团队建设，提高员工综合素质。

三、工作措施1. 市场调研与产品规划（1）针对不同消费群体，进行市场调研，了解消费者需求。

（2）根据市场调研结果，优化产品结构，推出符合市场需求的新产品。

（3）对现有产品进行升级，提高产品质量和性价比。

2. 营销策略（1）制定线上线下相结合的营销策略，扩大宣传范围。

（2）利用社交媒体、短视频平台等新媒体渠道进行宣传推广。

（3）举办各类促销活动，如限时折扣、满减优惠、赠品等，吸引消费者购买。

（4）与知名电商平台合作，扩大销售渠道。

3. 渠道拓展（1）加强与各大商超、家电卖场的合作，争取更多销售点。

（2）拓展线上销售渠道，如天猫、京东、拼多多等。

（3）发展加盟商，扩大销售网络。

4. 客户服务（1）设立客户服务中心，提供24小时咨询服务。

（2）对客户进行分类管理，针对不同客户需求提供个性化服务。

（3）开展客户满意度调查，及时了解客户需求，改进服务。

5. 团队建设（1）组织员工参加专业培训，提高业务能力。

（2）开展团队建设活动，增强团队凝聚力。

（3）设立激励机制，激发员工工作积极性。

四、时间安排1. 第一阶段（1-2月）：完成市场调研，优化产品结构，制定营销策略。

2. 第二阶段（3-4月）：开展线上线下宣传推广，拓展销售渠道。

3. 第三阶段（5-6月）：举办各类促销活动，提高销售业绩。

4. 第四阶段（7-8月）：总结经验，调整策略，为下一销售旺季做准备。

五、工作总结1. 定期召开销售会议，总结经验，分析问题，调整策略。

2. 对销售业绩进行跟踪分析，确保各项措施落实到位。

细胞侵袭必备技能——Transwell导读上周我们介绍了研究细胞迁移的体外方法——划痕实验，与此同时细胞侵袭也是与转移密不可分的。

那么今天要讲的是最常用的细胞侵袭方法：Transwell小室侵袭实验。

与细胞划痕实验相比，Transwell相对过程复杂，因此常常会出现各种问题，下面就一起看看Transwell侵袭实验中需要注意的细节吧！首先，为了对肿瘤侵袭和转移有更加清晰的理解，我们先来了解一下，肿瘤细胞转移的过程（如图1），主要包括以下5个过程：原位侵袭（Local invasion），肿瘤细胞内渗（Intravasation），循环系统存活（Survival in the circulation），肿瘤细胞外渗（Extravasation），形成转移灶（Micrometastasis formation）等[1]。

肿瘤细胞转移过程[1]其中细胞侵袭便发生在第一步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，后期才开始进行转移。

本期我们就为大家讲述利用transwell小室模拟细胞侵袭的实验方法。

Transwell 实验原理Trans可译为转移，穿过，而well则为小室的意思。

外形如同一个小杯子，杯底有通透性的膜（孔径0.1－12.0µm，细胞侵袭一般用8.0、12.0μm）。

实验原理：将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以膜相隔，并在膜上室铺基质胶，用来模拟体内细胞外基质。

如果上室的细胞要转移到下室，需先分泌基质金属蛋白酶（MMPs ）将基质胶降解，才能通过膜，最后通过计数下室的细胞量即可反映细胞的侵袭能力。

如下图右所示：Transwell装置图（左为外形，右为内部构造）侵袭过程：如下图为利用血清为诱导因子，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。

简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有血清培养基。

这样细胞放无血清的培养基里，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。

第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。

1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

Fig1但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

下图是一个Transwell装置的纵切面Fig2将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

Fig3应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。