Transwell侵袭实验全面总结

细胞侵袭转移实验报告细胞侵袭转移是癌症进展和转移的重要特征之一。

了解细胞的侵袭转移机制对于癌症预防和治疗具有重要意义。

本实验旨在研究细胞的侵袭转移能力，并探究其相关机制。

实验过程如下：1. 细胞培养与处理：选取一种具有侵袭能力的癌细胞株，如乳腺癌细胞MCF-7。

将细胞培养在含有适当营养和生长因子的培养基中，经过传代培养至适当细胞数目。

2. Transwell侵袭实验：将含有细胞的培养基加入到上游腔室中，下游腔室中加入含有化膜毛细孔的过滤膜，如Matrigel。

使细胞逐渐通过过滤膜向下游腔室侵袭。

培养一定时间后，取出过滤膜并使用染色剂染色，以观察和计数通过膜孔的细胞数量。

3. Western blot分析：用Western blot方法检测有关侵袭转移的分子标志物，如转录因子Snail和转录因子Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，转移至聚乙烯二醇膜上，用特异性抗体与目标蛋白结合。

通过免疫反应，使用化学发光显色剂检测目标蛋白的表达水平。

4. Real-time PCR分析：通过Real-time PCR技术检测相关基因的mRNA水平，包括Snail、Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取总RNA，逆转录为cDNA 后，用特异性引物进行PCR扩增。

通过观察PCR曲线和计算Ct值，比较各样本基因表达水平的差异。

实验结果如下：1. Transwell侵袭实验表明MCF-7细胞具有较强的侵袭能力。

染色显示通过过滤膜的细胞数量较多。

2. Western blot结果显示Snail、Slug和N-cadherin的蛋白表达水平较高，而E-cadherin的蛋白表达水平较低。

这表明细胞侵袭转移相关的转录因子和黏附分子表达异常。

3. Real-time PCR结果进一步证实了上述结果，Snail、Slug和N-cadherin的mRNA水平较高，而E-cadherin的mRNA水平较低。

transwell侵袭实验技术原理transwell是细胞迁移的常⽤检测⽅法，细胞迁移也称为细胞爬⾏、细胞移动或细胞运动，是指
细胞在接收到迁移信或感受到某些物质的梯度后⽽产⽣的移动。

细胞迁移是正常细胞的基本功能之⼀，是机体正常⽣长发育的⽣理过程，也是活细胞普遍存在的⼀种运动形式。

Transwell实验原理：⼩室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从⽽可以研究下层培养液中的成分对细胞⽣长、运动等的影响。

Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法我们所使用的是Chemicon公司的ECM554，基质胶已经包被好了，买来就可以用，很方便,而且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大。

这种胶4度下很软,37度则变得比较坚硬，因此用前应先放在培养箱中10分钟作用，使胶完全凝固。

该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色，再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。

我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目.结晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶标仪570nm检测，同样可以反应穿过细胞数因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数，因此建议有条件的话还是买这类已经铺好胶的试剂盒,比较可靠。

说明书该公司网上可以下载，对原理也有比较详细的阐述，可以去查一下.我们做的时候，上室用0.5％BSA的培养液，下室用5%血清的培养液,下室血清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整,如果细胞侵袭能力强,可适当降低血清浓度,否则可适当提高血清浓度。

需要注意的是：1。

上室内的细胞数目要适当，过多,穿过膜的细胞会过多过快，如果用计数法的话将难以计数；最少也要保证在收样的时候，上室内还要有细胞存在。

具体细胞密度需要自己摸索。

2。

细胞计数的准确性对结果影响很大，各组间最好不要分开计数.尽量用同一密度的细胞悬液给予不同处理,保证各组细胞量一致3.对细胞的处理不可影响细胞生存。

否则难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能力改变侵袭小室其实不止是transwell的,其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。

我用过Thincert,个人感觉不错,而且价格便宜,是grelner的,孔径8微米用于24孔板的一个才45块人民币，而且可以零买,不想transwell,总是一箱一箱的卖,实在是太贵了!侵袭实验要结合实验目的,不一定非要包被的。

下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤(摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert™ cell culture inserts》，大家如需要,可用google搜之：1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures2。

Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。

1．实验用品：Transwell小室：多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。

这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。

BD也有已包被好的，价格不清楚。

Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。

下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。

linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验。

iceyxy战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。

梅林战友提供的BD价格： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。

liguofan说国产的boyden30块一个。

jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。

平均每个20元不到。

Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。

一、实验目的1. 了解细胞侵袭的基本原理和实验方法。

2. 观察并分析细胞侵袭过程中的形态变化和迁移能力。

3. 探讨不同实验条件下细胞侵袭能力的差异。

二、实验原理细胞侵袭是指细胞穿越细胞外基质（ECM）进入周围组织的过程。

这一过程在肿瘤的侵袭转移、组织修复和炎症反应等生理和病理过程中具有重要意义。

细胞侵袭能力的强弱取决于细胞与ECM的相互作用以及细胞内信号转导途径的激活。

本实验采用Transwell小室法，通过观察细胞在ECM上的迁移和侵袭能力，评估细胞的侵袭能力。

三、实验材料1. 细胞：肿瘤细胞系A和正常细胞系B。

2. ECM：胶原蛋白I型、IV型。

3. Transwell小室：8μm孔径。

4. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清。

5. 细胞培养试剂：青霉素、链霉素。

6. 实验仪器：倒置显微镜、图像分析系统、离心机、培养箱等。

四、实验方法1. 细胞培养：将肿瘤细胞系A和正常细胞系B接种于6孔板，培养至对数生长期。

2. ECM包被：将Transwell小室的上室铺上胶原蛋白I型和IV型ECM，下室加入DMEM培养基。

3. 细胞侵袭实验：将细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入含有胎牛血清的DMEM培养基，培养24小时。

4. 洗涤：用PBS洗涤Transwell小室，去除未侵袭的细胞。

5. 染色：用结晶紫染色细胞，用吸水纸吸去多余染液。

6. 图像分析：在倒置显微镜下观察侵袭细胞，并使用图像分析系统计算侵袭细胞数。

五、实验结果1. 肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B。

2. 随着ECM浓度的增加，肿瘤细胞系A的侵袭能力逐渐减弱。

3. 在不同实验条件下，肿瘤细胞系A的侵袭能力存在显著差异。

六、讨论本实验结果表明，肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B，这可能与肿瘤细胞系A的ECM受体表达和信号转导途径的激活有关。

此外，ECM浓度对肿瘤细胞系A的侵袭能力具有调节作用，提示ECM在肿瘤侵袭转移过程中可能起到关键作用。

Transwell 侵袭实验一、实验原理将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

二、实验步骤1.将基质胶、Ep管、培养基、已放Transwell小室的24孔板提前放4℃预冷。

2.在冰上，基质胶：培养基= 1:8，预冷Ep管分别加106µl培养基+13.3µl基质胶（100µl/孔，配120µl）。

3.小室上孔迅速加100µl稀释的胶（垂直加入，铺平），37℃孵育1h，待胶凝固。

4.取适量细胞，离心后用无血清培养基重悬，上室加100µl。

（细胞接种数应该通过预实验确定）5.下室加入600µl含10% FBS的培养基。

6.37℃孵育24 h。

7.弃去上室内培养基，用棉签拭去上室残留的细胞，特别是边缘，棉签弄尖沿壁转一圈。

8.下室加600µl 4%多聚甲醛固定20min，PBS洗1-2遍，干燥。

9.下室加入400µl 0.1%结晶紫，染色10min10.PBS洗去残留染液。

11.将小室置于倒置显微镜下，观察拍照，取上、下、左、右、中五个视野计数，求平均值。

注：1.提前30min开制冰机。

2.拿小室时拿边缘，加基质胶时垂直加。

禁止在实际上方操作，准备好东西再配胶。

3.0.1%结晶紫：2.5%结晶紫配制成0.1%结晶紫溶液，400µl至10mL。

上室：采用无血清培养基，为维持细胞活性，可加入低浓度培养基，如2%或者5%。

下室：5%-10%FBS培养基，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

第1篇一、引言细胞侵袭是肿瘤发生发展过程中的关键步骤，也是肿瘤转移的先导环节。

为了研究肿瘤细胞的侵袭能力，本研究通过细胞侵袭实验，收集了不同处理条件下肿瘤细胞的侵袭数据。

本报告将对这些数据进行分析，旨在揭示肿瘤细胞侵袭能力的变化规律及其影响因素。

二、实验方法1. 细胞培养本研究选用人肺腺癌细胞系A549作为实验对象，将其接种于6孔板中，进行常规培养。

2. 细胞处理将A549细胞分为实验组和对照组，实验组采用不同浓度的药物进行处理，对照组采用等体积的溶剂进行处理。

3. 细胞侵袭实验采用Transwell小室进行细胞侵袭实验，将处理后的细胞接种于Transwell小室的上室，下室加入含有基质胶的培养基。

孵育一定时间后，取出小室，用棉签轻轻擦去未侵袭的细胞，用4%的甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下观察并计数侵袭细胞。

4. 数据分析采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，包括描述性统计、t检验、方差分析等。

三、结果与分析1. 细胞侵袭能力的变化（1）实验组细胞侵袭能力显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够增强肿瘤细胞的侵袭能力。

（2）随着药物浓度的增加，细胞侵袭能力逐渐增强（P<0.05），说明药物处理对细胞侵袭能力的影响呈剂量依赖性。

2. 影响细胞侵袭能力的因素（1）细胞周期：通过流式细胞术检测实验组和对照组细胞的周期分布，发现实验组细胞G2/M期比例显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够促进细胞周期向G2/M期转变，进而增强细胞侵袭能力。

（2）细胞黏附：通过检测实验组和对照组细胞的黏附能力，发现实验组细胞黏附能力显著低于对照组（P<0.05），说明药物处理能够降低细胞黏附能力，从而增强细胞侵袭能力。

（3）细胞骨架：通过免疫荧光技术检测实验组和对照组细胞骨架蛋白的表达，发现实验组细胞骨架蛋白的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明药物处理能够增强细胞骨架蛋白的表达，进而增强细胞侵袭能力。

细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验原理步骤详解细胞悬液100－200μL 加⼊上室，最后放⼊培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能⼒⽽定）。

今天主要介绍常⽤的细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验的原理和步骤⽅法。

和细胞划痕实验相⽐Transwell实验相对复杂⼀些，在实验过程中往往会出现各种问题，下⾯我们就⼀起来探讨下transwell侵袭实验中需要注意的⼀些细节！⾸先我们来看下图肿瘤细胞转移的5个主要过程，以便于对肿瘤侵袭和转移有个更加清晰的认识。

肿瘤细胞转移过程其中细胞侵袭便发⽣在第⼀步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进⼊⾎管、淋巴管的过程，后期才开始进⾏转移。

本期我们就为⼤家讲述利⽤transwell⼩室模拟细胞侵袭的实验⽅法。

Transwell侵袭实验的原理和过程transwell原理简单来说，将transwell⼩室放⼊培养板中，并将⾼营养液与低营养液⽤⼀层膜隔开，细胞放在低营养液中，⽽为了获更多的营养，细胞则会穿过这层膜，进⼊⾼营养液。

细胞transwell实验，可作为⼀种⾮常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的⽅法。

transwell⼩室的结构⽰意图如下左图；下右图为利⽤⾎清为诱导因⼦，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。

简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有⾎清培养基。

这样细胞放⽆⾎清的培养基⾥，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才⾏。

此时膜上涂⼀层基质胶，就可模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能⼒。

Transwell侵袭实验的具体步骤⼀、实验材料（提前1天准备）a）Transwell⼩室b）基质胶：常⽤的是⼈⼯重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。

因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。

它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

Transwell侵袭实验总结－Transwell的其他应用的实验步骤1．Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。

个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。

我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。

另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．Transwell上皮细胞培养步骤做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1). 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。

(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。

(4). 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。

(5). 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片3. Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

HEPG2细胞做侵袭实验细节Transwell 侵袭实验原理Transwell 侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。

它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。

今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。

我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。

而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。

Transwell 小知识②上层培养液：上层培养液采用低血清或无血清培养基，为维持渗透压。

⑤下层培养液：下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

下层也可用趋化因子，比如纤维粘连蛋白。

④基质胶：聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司、sigma叫ECM。

是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。

如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel 就不需要购买了。

实验步骤（1）基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；（2）基质胶使用：上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul)60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好，放入37℃培养箱中，孵育1-5h（<5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态;(注意：铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。