TRANSWELL 细胞迁移 侵袭实验

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)实验介绍：细胞迁移和侵袭实验是通过将Transwell小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，研究细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜下的共培养、细胞趋化、细胞迁移和侵袭等多种方面的实验。

实验步骤：1.材料准备：可拍照显微镜、Transwell小室（孔径8μm，没包被胶的），24孔板、BD公司的Matrigel、无血清DMEM、(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基、DMEM完全培养基、1640完全培养基（也可加到20%血清）、无菌PBS、棉签、胰酶、4%多聚甲醛固定液或者甲醇、结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）。

2.实验步骤：2.1 基质胶铺板：用XXX的Matrigel稀释1：8，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2 制备细胞悬液：细胞撤血清饥饿12-24小时后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3 接种细胞：取细胞悬液100µl加入Transwell小室，24孔板下室加入600µl含20%FBS的培养基。

注意避免气泡的产生。

2.4 培养细胞：常规培养12-48小时。

24小时较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

2.5 结果统计：通过给细胞染色，在镜下计数细胞。

胞悬液；将细胞悬液加入上室中央，保持液面水平；将下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基；37℃培养箱中孵育20-24小时；取出transwell，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色；用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

注意事项包括确保transwell在24孔板中浸泡1小时，消化细胞时用无血清培养基洗涤2次并计数，将细胞悬液加入上室中央保持液面水平，下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基，37℃培养箱中孵育20-24小时，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色，用棉球擦去上表面细胞，并小心避免混淆实验组和对照组。

细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

迁移实验（cell migration assay）欧阳家百（2021.03.07）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程 2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

细胞侵袭转移实验报告细胞侵袭转移是癌症进展和转移的重要特征之一。

了解细胞的侵袭转移机制对于癌症预防和治疗具有重要意义。

本实验旨在研究细胞的侵袭转移能力，并探究其相关机制。

实验过程如下：1. 细胞培养与处理：选取一种具有侵袭能力的癌细胞株，如乳腺癌细胞MCF-7。

将细胞培养在含有适当营养和生长因子的培养基中，经过传代培养至适当细胞数目。

2. Transwell侵袭实验：将含有细胞的培养基加入到上游腔室中，下游腔室中加入含有化膜毛细孔的过滤膜，如Matrigel。

使细胞逐渐通过过滤膜向下游腔室侵袭。

培养一定时间后，取出过滤膜并使用染色剂染色，以观察和计数通过膜孔的细胞数量。

3. Western blot分析：用Western blot方法检测有关侵袭转移的分子标志物，如转录因子Snail和转录因子Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，转移至聚乙烯二醇膜上，用特异性抗体与目标蛋白结合。

通过免疫反应，使用化学发光显色剂检测目标蛋白的表达水平。

4. Real-time PCR分析：通过Real-time PCR技术检测相关基因的mRNA水平，包括Snail、Slug、E-cadherin和N-cadherin等。

提取总RNA，逆转录为cDNA 后，用特异性引物进行PCR扩增。

通过观察PCR曲线和计算Ct值，比较各样本基因表达水平的差异。

实验结果如下：1. Transwell侵袭实验表明MCF-7细胞具有较强的侵袭能力。

染色显示通过过滤膜的细胞数量较多。

2. Western blot结果显示Snail、Slug和N-cadherin的蛋白表达水平较高，而E-cadherin的蛋白表达水平较低。

这表明细胞侵袭转移相关的转录因子和黏附分子表达异常。

3. Real-time PCR结果进一步证实了上述结果，Snail、Slug和N-cadherin的mRNA水平较高，而E-cadherin的mRNA水平较低。

细胞迁移和侵袭实验细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。

如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。

实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。

2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。

3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。

4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel 使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。

5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。

6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。

7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。

8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。

9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。

10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。

11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。

12.清洗transwell，可以反复使用。

培育技术中的细胞迁移和侵袭研究方法简介培育技术中的细胞迁移和侵袭是现代生物医学领域中重要的研究方向之一。

细胞迁移和侵袭能力是癌症发展和转移的关键步骤，因此了解和掌握这些研究方法对于深入研究癌症等疾病的发生和发展机制至关重要。

本文将对几种常见的培育技术中的细胞迁移和侵袭研究方法进行简介。

首先，细胞迁移和侵袭实验中最常用的方法是Transwell实验。

Transwell实验通过在一个具有孔洞的膜上涂覆细胞并将其置于培养皿中进行培养，通过孔洞上、下的培养液来观察细胞迁移和侵袭的情况。

该方法简单易行，可以模拟细胞穿过基底膜进入邻近组织的过程。

此外，也可将上下孔洞的培养液分别加入不同的试剂，以研究其对细胞迁移和侵袭能力的影响。

其次，划痕实验也是常用的细胞迁移实验方法之一。

该方法通过在细胞培养皿中划出一条明显的划痕，然后观察一定时间后细胞填充划痕的程度，来评估细胞的迁移能力。

划痕实验可以直观地观察到细胞的迁移情况，并且操作简单快捷。

然而，由于该方法不模拟细胞穿越基底膜的过程，所以不能全面评估细胞的侵袭能力。

除了以上两种方法，还有其他一些更加先进和精确的技术用于研究细胞迁移和侵袭。

例如，全息成像技术可以实时观察细胞的三维迁移和侵袭过程，提供更为全面的视角。

单细胞迁移技术可以追踪和记录单个细胞的迁移轨迹，揭示细胞迁移的空间和时间特征。

这些方法需要更加复杂的设备和技术条件，但可以提供更为准确和详细的研究结果。

在细胞迁移和侵袭研究中，细胞系的选择也是至关重要的。

常用的细胞系包括癌细胞和原代细胞。

癌细胞系具有较强的迁移和侵袭能力，是研究肿瘤转移的理想模型。

原代细胞系则来自于患者的组织，具有更高的生物学真实性。

不同细胞系的选择需要根据具体研究目的和实验要求进行。

细胞迁移和侵袭研究方法的发展为探索癌症转移的分子机制提供了重要工具和平台。

通过合理选择合适的实验方法和细胞系，研究者们可以逐步揭示细胞迁移和侵袭的调控机制，为深入理解癌症等疾病的发生和发展提供重要线索。

一、实验目的1. 了解细胞侵袭的基本原理和实验方法。

2. 观察并分析细胞侵袭过程中的形态变化和迁移能力。

3. 探讨不同实验条件下细胞侵袭能力的差异。

二、实验原理细胞侵袭是指细胞穿越细胞外基质（ECM）进入周围组织的过程。

这一过程在肿瘤的侵袭转移、组织修复和炎症反应等生理和病理过程中具有重要意义。

细胞侵袭能力的强弱取决于细胞与ECM的相互作用以及细胞内信号转导途径的激活。

本实验采用Transwell小室法，通过观察细胞在ECM上的迁移和侵袭能力，评估细胞的侵袭能力。

三、实验材料1. 细胞：肿瘤细胞系A和正常细胞系B。

2. ECM：胶原蛋白I型、IV型。

3. Transwell小室：8μm孔径。

4. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清。

5. 细胞培养试剂：青霉素、链霉素。

6. 实验仪器：倒置显微镜、图像分析系统、离心机、培养箱等。

四、实验方法1. 细胞培养：将肿瘤细胞系A和正常细胞系B接种于6孔板，培养至对数生长期。

2. ECM包被：将Transwell小室的上室铺上胶原蛋白I型和IV型ECM，下室加入DMEM培养基。

3. 细胞侵袭实验：将细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入含有胎牛血清的DMEM培养基，培养24小时。

4. 洗涤：用PBS洗涤Transwell小室，去除未侵袭的细胞。

5. 染色：用结晶紫染色细胞，用吸水纸吸去多余染液。

6. 图像分析：在倒置显微镜下观察侵袭细胞，并使用图像分析系统计算侵袭细胞数。

五、实验结果1. 肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B。

2. 随着ECM浓度的增加，肿瘤细胞系A的侵袭能力逐渐减弱。

3. 在不同实验条件下，肿瘤细胞系A的侵袭能力存在显著差异。

六、讨论本实验结果表明，肿瘤细胞系A在ECM上的侵袭能力明显强于正常细胞系B，这可能与肿瘤细胞系A的ECM受体表达和信号转导途径的激活有关。

此外，ECM浓度对肿瘤细胞系A的侵袭能力具有调节作用，提示ECM在肿瘤侵袭转移过程中可能起到关键作用。

Transwell细胞侵袭实验与移动实验一、试剂和耗材1)细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10%FBS的RPMI1640培养基及无血清RPMI1640培养基。

2)10×PBS (pH7.0)：Na2HPO4·12H2O （MW 358.4） 2.87gKH2PO4（MW 136.09）0.2gNaCl（MW 58.44）8.0gKCl（MW 74.55）0.2g去离子水至100 ml高压灭菌后，室温保存。

使用液为1×PBS(用无菌水进行1：9 稀释)。

3)冰乙酸:甲醛（1:3）4)Transwell小室(BD, Bioscience)5)Matrigel基质胶（BD, Bioscience，50ug/ml）：商品化，保存-20°。

6)各种规格的枪头、1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml的离心管于-20o C预冷，备用。

7)5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf），TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad）8)细胞计数板、6孔板二、实验步骤（一）侵袭实验1.润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min。

2.细胞准备：在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml无血清培养基，常规培养24h。

3.细胞的接种：1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1min以内。

3)弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；4)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细胞密度大于1.5×105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；5)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；6)将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl（含5×104细胞）逐滴加入小室；取500μl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。

1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。

ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。

ﻫ２。

3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。

其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。

由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。

在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。

肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。

最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。

Transwell实验的具体操作步骤如下：1.实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。

同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。

2.基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。

铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。

3.细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。

4.接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。

5.添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。

6.培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。

细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验原理步骤详解细胞悬液100－200μL 加⼊上室，最后放⼊培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能⼒⽽定）。

今天主要介绍常⽤的细胞侵袭⽅法：Transwell侵袭实验的原理和步骤⽅法。

和细胞划痕实验相⽐Transwell实验相对复杂⼀些，在实验过程中往往会出现各种问题，下⾯我们就⼀起来探讨下transwell侵袭实验中需要注意的⼀些细节！⾸先我们来看下图肿瘤细胞转移的5个主要过程，以便于对肿瘤侵袭和转移有个更加清晰的认识。

肿瘤细胞转移过程其中细胞侵袭便发⽣在第⼀步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进⼊⾎管、淋巴管的过程，后期才开始进⾏转移。

本期我们就为⼤家讲述利⽤transwell⼩室模拟细胞侵袭的实验⽅法。

Transwell侵袭实验的原理和过程transwell原理简单来说，将transwell⼩室放⼊培养板中，并将⾼营养液与低营养液⽤⼀层膜隔开，细胞放在低营养液中，⽽为了获更多的营养，细胞则会穿过这层膜，进⼊⾼营养液。

细胞transwell实验，可作为⼀种⾮常简便的研究肿瘤细胞迁移、侵袭以及转移情况的⽅法。

transwell⼩室的结构⽰意图如下左图；下右图为利⽤⾎清为诱导因⼦，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。

简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有⾎清培养基。

这样细胞放⽆⾎清的培养基⾥，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才⾏。

此时膜上涂⼀层基质胶，就可模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能⼒。

Transwell侵袭实验的具体步骤⼀、实验材料（提前1天准备）a）Transwell⼩室b）基质胶：常⽤的是⼈⼯重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。

因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。

它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

Transwell迁移侵袭实验分享Transwell迁移/侵袭实验基本原理将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

侵袭实验中使用到的Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

Transwell小室的滤膜孔径一般为8μm，在侵袭实验中，膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。

细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。

计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

所需材料Ø Transwell小室Ø细胞生长培养基Ø胎牛血清Ø胰蛋白酶Ø PBSØ青霉素-链霉素溶液（100×）Ø结晶紫或台盼蓝Ø甲醇Ø Matrigel（侵袭实验）主要试剂配置（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存。

（2）细胞生长培养基：-20℃保存，临用前按体积比配成含10% FBS和1%青霉素-链霉素双抗的完全培养液。

操作步骤1．所有细胞培养试剂和细胞培养池放在37℃温育；2．待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105 /ml；如进行侵袭实验，将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜，在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基稀释至300 μl/ml，取100 μl均匀涂抹一层于细胞培养池的PET膜上表面，然后将培养池轻轻放入24孔板孔内，37℃放置3 h左右，取出于超净工作台过夜干燥。

Transwell侵袭实验总结－Transwell的其他应用的实验步骤1．Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。

个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。

我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。

另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．Transwell上皮细胞培养步骤做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1). 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。

(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。

(4). 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。

(5). 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片3. Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

transwell实验原理与步骤Transwell实验是一种常见的细胞迁移和侵袭性研究的方法。

它广泛用于评估细胞的迁移能力、侵袭能力以及药物对这些能力的影响。

Transwell实验基于孔板中半透膜的整体设计，使得细胞可以在孔板上的上下两侧进行迁移和侵袭。

下面将详细介绍Transwell实验的原理和步骤。

1. Transwell实验的原理Transwell实验中使用的是Transwell孔板，该孔板由上下两个室组成，通过半透膜分隔开。

半透膜通常由聚碳酸酯或聚膠（polyethylene terephthalate）制成，具有特定的孔径。

孔板上室称为上室，下室称为下室。

上室用于装载待测的细胞，下室则添加诱导迁移或侵袭的化学物质。

Transwell实验的原理是利用孔板的半透膜，使得细胞可以通过孔板上下两侧进行迁移和侵袭。

细胞在上室中培养，通过半透膜向下室中迁移和侵袭。

迁移和侵袭的细胞数量可以通过染色或其他方法来定量。

同时，可以添加不同的化学物质于上室或下室，以评估这些化学物质对细胞迁移和侵袭能力的影响。

2. Transwell实验的步骤Transwell实验的步骤主要包括预处理Transwell孔板、细胞培养、细胞处理、迁移或侵袭实验、染色和结果分析。

(1) 预处理Transwell孔板将Transwell孔板放入含有适当的细胞培养基的无菌培养皿中，在37℃的恒温培养箱中预温30分钟。

然后，将细胞培养基完全移除并在烘箱中干燥。

(2)细胞培养将需要进行迁移和侵袭实验的细胞培养至合适的数量和状态。

注意要保持细胞处于对下一步实验的最佳状态，例如在对照组、实验组之间生长均匀。

(3)细胞处理将预处理后的Transwell孔板放入一个无菌培养皿中。

然后，向上室中加入适当数量的细胞悬液。

根据实验要求，可以在上室中添加不同浓度的细胞。

(4)迁移或侵袭实验在下室中加入化学物质，例如诱导剂或特定药物。

这些化学物质可以模拟体内环境，刺激细胞的迁移或侵袭能力。

Transwell用于迁移实验和侵袭实验的方法Transwell用于细胞迁移实验和侵袭实验的不同:对于肿瘤细胞而言，迁移看的是肿瘤细胞迁移的快慢和程度。

而肿瘤细胞侵袭是肿瘤细胞进行迁移它就必须分泌金属蛋白MMP9，而基质胶的作用相当于模拟人体类的基质。

方法：1 Transwell实验检测新鱼腥草素钠对食管癌细胞迁移的影响（1）取对数生长期的Kyse-450、Eca-109和TE1细胞，消化、离心、重悬并进行细胞计数，调整细胞浓度为1×105/mL；（2）100μL细胞悬液接种于transwell上室。

（注意上室的细胞悬液中不含血清）；（3）添加600μL FBS含量为20%的完全培养基于下室；（4）设置对照组及实验组，实验组药物加于transwell上室中，Kyse-450细胞系药物终浓度为0、100、200、300μg/mL，培养24h；Eca-109、TE1两种细胞系药物终浓度为0、50、100、200μg/mL；（5）24h后，将上室和下室的液体吸出，PBS清洗上室两遍。

使用松软的棉花去除小室内细胞，即未穿透过小室的细胞；（6）4%甲醛固定上室穿透过的细胞，固定15min；（7）固定过后，风干上室10min，用0.5%结晶紫染色20min；（8）PBS清洗3遍，从边缘吸干水分，拍照记录，每个小室随机拍摄5个位置，每个实验重复3次。

2Transwell检测细胞侵袭2.1 Matrigel胶分装处理（1）将Matrigel基质胶放于冰盒，再同冰盒一起放在4℃冰箱的里面，过夜融化，随时观看瓶中的基质胶状态，确认基质胶完全融化；（2）根据实验需求计算出一次的价值叫用量进行分装，在分装时与Matrigel胶接触的全部用品均需预冷，所有操作过程在冰上低温无菌操作，分装放置在－80℃冰箱，保留货号，不能重复冻融使用；（3）当胶浓度＜3mg/mL时，不会成胶；（4）融化后的Matrigel胶为澄清液体。